TLR-4及NF-κB信號轉導通路在大鼠慢性高眼壓視網膜損傷中的作用及機制的探討.pdf

1、目前青光眼已被列為世界上第二位的致盲眼病，但其發(fā)病機制還不十分清楚，世界上尚無一種視神經保護藥物能夠通過美國的食品藥品監(jiān)督管理局的審核批準投入到臨床使用。目前迫切的需要對青光眼視神經保護進行深入的研究，而神經免疫保護是最新提出的防止RGCs進行性喪失的策略之一。在世界范圍內，青光眼視神經損害的免疫學機制及視神經保護的免疫學途徑越來越受到研究者們的關注，國外的研究認為，由于自身免疫調節(jié)的紊亂，導致視網膜及視神經的某些成分改變而具有抗原性，

2、從而引發(fā)自身免疫反應，導致視網膜及視神經損害。 免疫系統(tǒng)在青光眼發(fā)病中所起的作用是雙重的，既有神經保護作用亦有神經損害作用。更好地了解免疫系統(tǒng)在青光眼視神經損傷中的作用，將會幫助我們在青光眼的防治上形成一更好的防治策略。對于青光眼的病人，如何使得保護性免疫與自動免疫引起的神經退行性病變損傷相平衡將決定神經節(jié)細胞的命運。 CNS通過自身的膠質細胞和浸潤至CNS的效應細胞行使免疫防御功能，TLR4是一固有免疫之受體，小膠質

3、細胞表達TLRs與其活化狀態(tài)是密切相關的，能和PAMPs結合的TLRs在小膠質細胞上的表達提供了一個在病原刺激與免疫應答之間關鍵的聯(lián)系機制，外源的病原體通過與TLRs結合啟動固有免疫應答進而促進獲得性免疫應答。而TLR4在青光眼視神經損傷中的具體作用機制不詳。本課題擬從基因及蛋白水平上研究TLR4和其NF—κB信號轉導在小膠質細胞活化中的作用及意義，利用免疫組化的方法研究TLR4和小膠質細胞在正常大鼠視網膜與慢性高眼壓視網膜上的表達部位

4、與相關性，并探討TLR4及其NF—κB信號通路在視神經損傷中的可能的作用機制。為深入揭示TLR4與小膠質細胞的功能關系，尋找有效的TLR拮抗劑或是阻斷TLR信號通路以實現最佳的小膠質細胞活化狀態(tài)，為青光眼視神經損傷的免疫治療提供理論依據。 材料與方法： 1、大鼠慢性高眼壓模型的制備：燒烙3條鞏膜靜脈術中聯(lián)合絲裂霉素的應用建立大鼠慢性高眼壓模型。TONO-PENⅡ型筆式眼壓計測量術前，術后30min、2h、1d、3d、7d

5、、14d、28d、56d眼壓。 2、光鏡下視網膜形態(tài)學的觀察：HE染色，并測量視網膜內界膜至外界膜距離即視網膜厚度。 3、模型建立后2h、1d、3d、7d，、4d、28d、56d分別取5只高眼壓組、假手術組及空白對照組大鼠鼻側一半視網膜，在視網膜鋪片上行免疫組織化學染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察視網膜TLR4、小膠質細胞的表達情況。 4、應用RT-PCR法檢測各組視網膜組織中TLR4、小膠質細胞的基因mRNA表達

6、及Western—Blot法檢測各組視網膜組織中TLR4、小膠質細胞的蛋白質的表達，統(tǒng)計結果均以均數±標準差表示，多組均數間的比較用oneway—ANOVA分析，手術組與空白對照組均數間的比較用配對t檢驗分析，均用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析。 5、小膠質細胞活化模型的建立：在小膠質細胞的培養(yǎng)基上劃痕建立的小膠質細胞活化的細胞模型，應用RT-PCR法檢測各組小膠質細胞中TLR4、P50、IL—6、TNF-α的基因mRNA表達

7、及Western—Blot法檢測各組視網膜組織中TLR4、P50、IL—6、TNF-α的蛋白質的表達，并檢驗封閉NF—κB信號通路后各組視網膜組織中P50、IL—6、TNF-α的蛋白質及基因mRNA的表達，統(tǒng)計結果均以均數±標準差表示，多組均數間的比較用oneway—ANOVA分析，劃痕組與對照組均數間的比較用配對t檢驗分析，均用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析。 結果： 1、大鼠慢性高眼壓模型眼的術后各時間點的眼壓與假

8、手術組及空白對照組的差異具有統(tǒng)計學意義。 2、大鼠慢性高眼壓模型眼的術后各時間點的光學顯微鏡顯示視網膜厚度經歷一由厚變薄的過程。 3、大鼠慢性高眼壓模型眼的術后各時間點的免疫組化結果顯示TLR4和小膠質細胞在視網膜組織中早期即有表達，術后7d達高峰。 4、大鼠慢性高眼壓模型眼的術后各時間點的Western—Blot顯示TLR4和小膠質細胞在視網膜組織中早期即有表達，結果顯示TLR4和小膠質細胞在時空上具有相關性。

9、 5、小膠質細胞活化的細胞模型的各實驗組及各時間點的Western—Blot、RT-PCR顯示TLR4、IL—6、TNF-α、P50的蛋白表達組間差異具有統(tǒng)計學意義。 結論： 1、正常大鼠視網膜組織的色素上皮層可見TLR4的少量表達，并可見靜態(tài)的小膠質細胞存在。 2、TLR4在大鼠慢性高眼壓不同時間點的視網膜上的表達，體現了其在大鼠慢性高眼壓視神經退行性病變中的免疫調節(jié)作用。 3、小膠質細胞的活化