飛龍掌血鎮(zhèn)痛抗炎活性成分及其作用機制研究.pdf

1、飛龍掌血Toddalia asiatica Lam.為蕓香科（Rutaceae）飛龍掌血屬（Toddalia）植物，在我國的地理位置分布為秦嶺以南各地。味辛、微苦，性溫，具有祛風除濕、散瘀止血、消腫解毒的功效。飛龍掌血主要用來治療跌打損傷、風濕骨痛、腰痛、痛經(jīng)以及毒蛇咬傷等病癥，效果顯著，且民間用于治療類風濕性關(guān)節(jié)炎（RA）的藥用歷史悠久。生物堿類與香豆素是該植物中的兩大類主要成分，關(guān)于其發(fā)揮鎮(zhèn)痛抗炎作用的活性成分及作用機制的報道均較少

2、。本課題擬進一步研究飛龍掌血的鎮(zhèn)痛抗炎活性部位和活性單體成分，并考察其發(fā)揮鎮(zhèn)痛抗炎作用的機制。
　　一．飛龍掌血各部位的免疫調(diào)節(jié)作用及其鎮(zhèn)痛抗炎活性的研究
　　將藥材粗粉采用熱回流提取得到總膏，依次萃取得生物堿部位和乙酸乙酯部位（將其進一步分為EⅠ、EⅡ、EⅢ三個部位）并作為研究對象，實驗內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　1．免疫調(diào)節(jié)作用的考察：生物堿部位和乙酸乙酯部位對刀豆蛋白A和脂多糖誘導小鼠脾臟T、B淋巴細胞增殖的作用進行M

3、TT檢測，然后對T細胞CD4與 CD8亞群進行流式檢測，結(jié)果表明它們均能通過改變 T淋巴細胞（CD4+、CD8+）的數(shù)目或亞群來調(diào)節(jié)機體的免疫功能。
　　2．體內(nèi)鎮(zhèn)痛抗炎活性研究：采用小鼠醋酸扭體、熱板法和二甲苯致小鼠耳腫脹三個實驗，結(jié)果顯示生物堿部位、乙酸乙酯部位及其EⅠ部位具有較好的鎮(zhèn)痛及抗炎活性，能顯著抑制小鼠的扭體反應和耳腫脹程度，降低痛閾值。同時采用納洛酮拮抗實驗和利血平影響實驗初步考察其鎮(zhèn)痛機制，結(jié)果表明生物堿部位的鎮(zhèn)

4、痛作用受到利血平的拮抗，而乙酸乙酯及其EⅠ部位的鎮(zhèn)痛作用部分被納洛酮拮抗。
　　3．抗RA活性研究：采用Ⅱ型膠原建立CIA小鼠模型，檢測各部位對CIA小鼠的體重、足腫脹程度、脾臟指數(shù)、關(guān)節(jié)病理變化及評分、血清中細胞因子水平的影響，結(jié)果表明生物堿部位和乙酸乙酯EⅠ部位對CIA模型均具有顯著的改善作用，能通過緩解脾臟腫大及調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子-α與白介素-17、-6、-10四種因子的水平而改善其足墊和踝關(guān)節(jié)的腫脹，抑制滑膜和軟骨的異常增生

5、與侵蝕等。
　　二．飛龍掌血的體外抗炎活性及機制的研究
　　以飛龍掌血浸膏及部分單體化合物（香豆素和生物堿）為研究對象，實驗內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　1．對LPS誘導RAW264.7巨噬細胞增殖的影響：采用MTT法研究其對該模型是否具有細胞毒作用，結(jié)果表明其總膏、生物堿部位和乙酸乙酯EⅠ部位以及茴芹內(nèi)酯、toddaculin、異茴芹內(nèi)酯、氧化白屈菜堿在高濃度時具有一定的細胞毒性，而omphalocarpin、二氫白屈菜紅堿

6、、茵芋堿、γ-花椒堿均無明顯的細胞毒性。
　　2．對NO水平的調(diào)節(jié)：采用Griess法檢測它們對細胞培養(yǎng)上清液中NO水平的影響，結(jié)果顯示除茴芹內(nèi)酯、toddaculin、異茴芹內(nèi)酯、氧化白屈菜堿以外，其余成分均具有一定的NO抑制作用。
　　3．對TNF-α、IL-6、COX-2和iNOS水平的影響：采用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液中幾種炎癥介質(zhì)水平的變化，結(jié)果表明飛龍掌血總膏、生物堿部位和乙酸乙酯EⅠ部位以及omphalo

7、carpin、茵芋堿均可顯著下調(diào)這幾種因子的水平。
　　4．茵芋堿與omphalocarpin對COX-2、iNOS的表達以及NF-κB通路的影響：采用Western Blotting法，結(jié)果顯示二者均能顯著抑制COX-2和iNOS兩種蛋白的表達及 NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性（抑制胞漿中 IκB-α蛋白的磷酸化以及 NF-κB p65蛋白易位至細胞核的水平），說明它們可能通過抑制 NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性下調(diào)各種炎性介質(zhì)如NO、TNF-α、

8、IL-6、COX-2和iNOS的水平。
　　5．對RA成纖維樣滑膜細胞（FLS）的增殖及其釋放MMP-3和IL-1β的影響：采用CCK-8法研究對RA FLS增殖的作用，并運用流式細胞術(shù)檢測其對細胞周期的影響，ELISA法檢測MMP-3和IL-1β的水平，結(jié)果表明飛龍掌血總膏、生物堿部位和乙酸乙酯EⅠ部位以及茵芋堿、omphalocarpin均能使細胞大量停留于DNA合成前期，從而抑制 TNF-α誘導 RA FLS增殖的程度，同時

9、明顯下調(diào)RA FLS分泌MMP-3和IL-1β的水平。
　　三．主要化學成分的鎮(zhèn)痛抗炎活性研究
　　以茴芹內(nèi)酯、異茴芹內(nèi)酯、omphalocarpin和茵芋堿四個主要成分為研究對象，實驗內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　1．體內(nèi)鎮(zhèn)痛抗炎活性研究：采用小鼠醋酸扭體、熱板法和二甲苯致小鼠耳腫脹三個實驗，結(jié)果顯示茵芋堿與omphalocarpin具有較好的活性，能顯著抑制小鼠的扭體反應和耳腫脹程度，降低痛閾值。同時采用納洛酮拮抗實驗和利

10、血平影響實驗初步考察其鎮(zhèn)痛機制，結(jié)果表明二者的鎮(zhèn)痛作用受到利血平的拮抗，而不受納洛酮的影響。
　　2．抗 RA活性研究：采用Ⅱ型膠原作為誘導劑以建立關(guān)節(jié)炎小鼠模型，檢測單體成分對CIA小鼠的體重、足腫脹程度、脾臟指數(shù)、關(guān)節(jié)病理變化及評分、血清中細胞因子水平的影響，結(jié)果表明茵芋堿對CIA小鼠的關(guān)節(jié)癥狀具有明顯的緩解作用，能通過減輕脾臟腫大及調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子-α與白介素-1β、-6、-10的水平而改善其足墊和踝關(guān)節(jié)的腫脹，抑制滑膜和軟

11、骨的異常增生與侵蝕等。
　　本課題進一步明確了飛龍掌血的鎮(zhèn)痛抗炎活性成分及其機制，并首次篩選了飛龍掌血中主要單體成分的鎮(zhèn)痛抗炎活性及抗RA作用；首次采用T、B淋巴細胞的體外增殖模型研究了飛龍掌血的免疫調(diào)節(jié)作用；首次采用納洛酮拮抗實驗和利血平影響實驗初步考察了各活性成分的鎮(zhèn)痛作用機制；同時首次通過 LPS誘導RAW264.7巨噬細胞增殖和TNF-α誘導大鼠RA FLS增殖的模型深入探究了飛龍掌血的抗炎作用機制。以上結(jié)果說明飛龍掌血可