PEDF基因在乳腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用與機制研究.pdf

1、此研究首次探討PEDF蛋白在乳腺癌中表達與乳腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系及其在乳腺癌浸潤轉(zhuǎn)移中的作用，與Vimentin、E-cadherin、Snail、NF-κB這幾種蛋白質(zhì)的聯(lián)合檢測利于評估腫瘤的生物學(xué)行為及預(yù)后，有助于對指導(dǎo)乳腺癌的治療和提高療效。觀察PEDF是否通過介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化來參與乳腺癌的浸潤轉(zhuǎn)移，這一發(fā)現(xiàn)將為乳腺癌尋找新的治療藥物和作用靶點奠定基礎(chǔ)。
　　第一部分PEDF蛋白在乳腺癌中的表達及其與EMT

2、相關(guān)性研究
　　研究目的:
　　1.通過對乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織標(biāo)本中PEDF、Vimentin、E-cadherin、Snail、NF-κB表達研究，檢測PEDF基因是否參與了乳腺癌組織的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，并檢測與乳腺癌級別、組織臨床病理參數(shù)、分子分型的關(guān)系、闡明PEDF基因在乳腺癌EMT中的調(diào)節(jié)作用;
　　研究方法:
　　1.采用免疫組化方法檢測119例原發(fā)性乳腺癌組織和30例癌旁乳腺組織中PEDF基因、間質(zhì)

3、性標(biāo)記基因Vimentin、上皮性標(biāo)記基因E-cadherin、轉(zhuǎn)錄因子Snail及NF-κB蛋白的表達，比較乳腺癌組織和正常乳腺組織中這五個指標(biāo)的表達情況.
　　2.統(tǒng)計學(xué)分析:數(shù)據(jù)分析采用SPSS13.0(SPSS，Inc.Chicago，IL，USA)統(tǒng)計軟件,單因素和多因素分析PEDF、Vimentin、E-cadherin、Snail、NF-κB蛋白與臨床病理特征的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　實驗

4、結(jié)果:
　　1.PEDF、 E-cadherin、Vimentin、Snail及NF-κB蛋白在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中的陽性表達率分別為44.5％、49.5％、47.9％、57.1％;高表達的PEDF蛋白與低表達E-cadherin蛋白、高表達Snail蛋白、NF-κB蛋白有統(tǒng)計學(xué)意義的相關(guān)性，其中高表達的PEDF蛋白與低表達E-cadherin蛋白是中等相關(guān)，與高表達Snail蛋白、NF-κB蛋白是弱相關(guān)（P＜0.001，r=0

5、.496、r=0.34、F0.383）。
　　2.PEDF蛋白在浸潤性乳腺癌中的表達與腫瘤大小相關(guān)（P=0.039）;而與患者年齡、TNM分期、組織學(xué)類型、ER受體、PR受體、腋窩淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移無關(guān)（P=0.809、P=0.240、P=0.113、P=0.862、P=0.137、P=0.555）。Vimentin蛋白在浸潤性乳腺癌中的表達與腫瘤TNM分期、腫瘤大小、腋窩淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移、PR受體、組織學(xué)類型、有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001

6、、P=0.017; P＜0.001、P=0.008、P=0.005)而與患者年齡、ER受體相關(guān)無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.407、P=0.248)。E-cadherin蛋白在浸潤性乳腺癌中的表達與腫瘤大小、TNM分期、PR受體、腋窩淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移相關(guān)有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.004、P＜0.001、P=0.014、P=0.013）;而與患者年齡、組織學(xué)類型、ER受體相關(guān)無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.929、P=0.126、P=0.314);Snail蛋白高

7、表達與腫瘤大小、腋窩淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001、P＜0.001、P=0.001），而與患者年齡、組織學(xué)類型、ER受體、PR受體相關(guān)無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.775、P=0.672、P=0.348、P=0.111):NF-κB蛋白高表達與腫瘤大小、組織學(xué)分級、腋窩淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移狀態(tài)、TNM分期相關(guān)（P=0.001、P=0.001、P=0.001，P＜0.001），而與患者年齡、ER受體、PR受體相關(guān)無統(tǒng)計學(xué)意義(P

8、=0.246、P=0.419、P=0.186)。
　　3.在119例浸潤性導(dǎo)管癌中，應(yīng)用Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn):高表達Vimentin、Snail and NF-κB與E-cadherin低表達成負(fù)相關(guān)(P＜0.001，r=-0.613，P＜0.001，r=-0.48，P＜0.001，r=-0.519)。Vimentin高表達與Snai核高表達、NF-κB高表達均稱成正相關(guān)（P＜0.001、r=0.428;P=0.002、

9、r=0.291）。此外，PEDF高表達與E-cadherin低表達成正相關(guān)(P＜0.001、r=0.496)，反而與Vimentin高表達、Snail高表達、NF-κB高表達成負(fù)相關(guān)(P＜0.001，r=-0.337; P＜0.001，r=0.34; P＜0.001，r=0.383)。
　　4.應(yīng)用Cox回歸模型單因素分析確認(rèn)PEDF、Vimentin、E-cadherin、Snail及NF-κB陽性表達（P=0.006、P＜0.

10、001、P＜0.001、P=0.001、P＜0.001），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.015)，腫瘤直徑(P=0.012)，病理分期（P=0.012）及PR受體情況（P=0.003）為矯正其因素后有統(tǒng)計學(xué)意義;年齡、月經(jīng)狀況、組織學(xué)分級、ER狀態(tài)均無統(tǒng)計學(xué)意義。多因素分析顯示Vimentin與E-cadherin陽性表達是總生存(OS;P=0.016，HR=0.429,95％CI:0.215-0.857及P=0.004，HR=3.274,95％

11、CI:1.476-7.262)有統(tǒng)計學(xué)意義的預(yù)后影響因素，PEDF、腫瘤直徑是無疾病復(fù)發(fā)率(DFS)有統(tǒng)計學(xué)意義的預(yù)后影響因素(DFS; P=0.034，HR=0.723，95％CI:0.361-1.446及P=0.042，HR=1.245,95％CI:1.008-1.537)。
　　第二部分干擾抑制PEDF蛋白表達對乳腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及體外侵襲轉(zhuǎn)移的影響
　　研究目的:
　　通過對乳腺癌Sk-Br-3細(xì)胞系的穩(wěn)定

12、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定干擾PEDF基因乳腺癌細(xì)胞進行檢測，對其增殖、侵襲和凋亡的影響來闡述PEDF基因在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的可能作用;
　　研究方法:
　　1.分別設(shè)計siRNA，干擾PEDF在乳腺癌Sk-Br-3細(xì)胞中表達(PEDF-siRNA);設(shè)計包裝慢病毒質(zhì)粒，在Sk-Br-3細(xì)胞包裝和擴增(Lentivirus-PEDF-vector)，然后分別將有效干擾序列轉(zhuǎn)染乳腺癌Sk-Br-3細(xì)胞，采用免疫熒光染色法檢測PEDF表達下調(diào)/

13、擴增后對細(xì)胞骨架形態(tài)的影響;分析轉(zhuǎn)染PEDF-siRNA/Lentivirus-PEDF-vector質(zhì)粒后人乳腺癌Sk-Br-3細(xì)胞PEDF蛋白表達的變化;
　　2.通過Transwell小室法侵襲實驗，檢測轉(zhuǎn)PEDF-siRNA/Lentivirus-PEDF-vector質(zhì)粒組、正常對照組和陰性對照組乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力，分析PEDF-siRNA/Lentivirus-PEDF-vector質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對于人乳腺癌Sk-Br-3

14、細(xì)胞增殖能力的影響。
　　3.應(yīng)用RNA干擾(RNAinterference，RNAi)技術(shù)，沉默PEDF基因，觀察乳腺癌細(xì)胞體外增殖、侵襲、粘附特性的變化以及應(yīng)用Western blotting技術(shù)檢測人乳腺癌Sk-Br-3細(xì)胞的上皮性標(biāo)記E-cadherin、間質(zhì)性標(biāo)志Vimentin表達的改變，探討PEDF基因在乳腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程;
　　4.應(yīng)用慢病毒包裝包裝輔助質(zhì)粒技術(shù)，擴增PEDF基因，轉(zhuǎn)染乳腺癌Sk-Br-3

15、細(xì)胞，觀察乳腺癌細(xì)胞體外增殖、侵襲、粘附特性的變化以及應(yīng)用Western blotting技術(shù)檢測人乳腺癌Sk-Br-3細(xì)胞的上皮性標(biāo)記E-cadherin、間質(zhì)性標(biāo)志Vimentin表達的改變，探討PEDF基因在乳腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程;
　　實驗結(jié)果:
　　1.在Sk-Br-3細(xì)胞中抑制PEDF的表達和在Sk-Br-3細(xì)胞中升高PEDF的表達后進行transwell實驗，結(jié)果表明PEDF可以明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能

16、力。此外，在Sk-Br-3中過表達PEDF后，免疫熒光染色顯示Sk-Br-3細(xì)胞骨架形態(tài)由間質(zhì)樣變?yōu)樯掀印?br>　　2.Western blotting檢測正常對照組和陰性對照細(xì)胞組的PEDF蛋白表達明顯高于轉(zhuǎn)染siRNA質(zhì)粒細(xì)胞組的蛋白表達水平，低于Lentivirus-vector質(zhì)粒細(xì)胞組的蛋白表達水平差異具有顯著性(P＜0.05)，其中轉(zhuǎn)染siRNA質(zhì)粒組蛋白表達水平最低;
　　3.Western blotting檢測

17、在Sk-Br-3中過表達PEDF后結(jié)果顯示Sk-Br-3細(xì)胞中上皮細(xì)胞標(biāo)志分子E-cadherin表達顯著上調(diào)，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志分子Vimentin的表達則顯著下調(diào);反而轉(zhuǎn)染PEDF-siRNA組結(jié)果顯示Sk-Br-3細(xì)胞中上皮標(biāo)志分子的表達顯著下調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志分子的表達顯著上調(diào)。
　　4.統(tǒng)計學(xué)分析:采用SPSS13.0(SPSS，Inc.，Chicago，IL，USA)統(tǒng)計軟件。使用t檢驗或方差分析細(xì)胞遷徙能力和蛋白表達狀況，統(tǒng)計