表皮生長因子(EGF)基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞修復創(chuàng)面的實驗研究.pdf

1、目的：
　　 造成皮膚組織缺損后創(chuàng)面難以愈合的主要原因包括修復細胞缺乏和促進創(chuàng)傷修復的各種生物活性因子的減少。如何在無足夠自體皮膚進行移植等限制下，及時有效的修復難愈創(chuàng)面以盡可能達到恢復皮膚正常功能的愈合，是目前創(chuàng)面臨床治療的難點。因此本研究擬通過AAV介導EGF基因修飾骨髓MSCs，探討其對于促進創(chuàng)面修復的可能性，為皮膚組織工程種子細胞的來源及轉(zhuǎn)基因技術(shù)用于促進創(chuàng)面愈合提供一定的理論基礎(chǔ)及實踐依據(jù)。
　　 方法與結(jié)果：

2、
　　 1．構(gòu)建攜帶EGF基因的重組腺相關(guān)病毒載體
　　 通過RT-PCR從胎盤組織中擴增出175bp大小的EGF基因，將其克隆入pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞。提取此重組質(zhì)粒DNA并用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalⅠ酶切，獲得兩端分別帶有EcoRI和SalⅠ不同酶切位點的EGF基因片段，最終將其克隆入pAAV-IRES-hrGFP質(zhì)粒中，通過酶切和測序鑒定，證明成功構(gòu)建了pAAV-EGF-GFP質(zhì)粒。
　　

3、 2．AAV-EGF病毒的包裝、純化與檢測
　　 將pAAV-EGF-GFP、pAAV-RC、pHelper3種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細胞，包裝含有EGF基因的AAV-EGF病毒載體；通過“氯仿處理-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提”法純化AAV-EGF；用SDS-PAGE膠電泳檢測AAV的純度，以點雜交檢測AAV的滴度。最終證明獲得高純度高滴度的AAV-EGF病毒。
　　 3．骨髓間充質(zhì)干細胞的分離與培養(yǎng)
　　

4、采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁法體外培養(yǎng)獲取小鼠骨髓MSCs，并誘導MSCs向成骨、成軟骨和成脂肪三個方向分化，分別采用Von Kossa法、阿爾新藍麗春紅染色和油紅0染色方法進行檢測。結(jié)果表明通過體外原代和傳代培養(yǎng)獲得的純化的小鼠MSCs具有向多個方向分化的能力，我們所培養(yǎng)的細胞為骨髓間充質(zhì)干細胞。
　　 4.AAV-EGF轉(zhuǎn)染MSCs細胞
　　 以獲取的AAV-EGF病毒轉(zhuǎn)染MSCs細胞，分別于培養(yǎng)3d、14d、27d后