骨肉瘤腫瘤血管生成與微血管密度在瘤體內(nèi)的分布差異研究.pdf

1、目的：觀察人骨肉瘤與荷人骨肉瘤皮下移植瘤瘤體內(nèi)不同區(qū)域VEGF和微血管密度(microvessel density，MVD)的分布是否存在差異，分析瘤體內(nèi)不同區(qū)域VEGF表達(dá)與MVD的關(guān)系，為臨床上骨肉瘤標(biāo)本取材部位的確定以及有關(guān)骨肉瘤腫瘤血管生成的臨床與基礎(chǔ)研究提供實(shí)驗(yàn)參考。 方法： 1.選取3例經(jīng)手術(shù)切除的完整的骨肉瘤標(biāo)本，以腫瘤中心為原點(diǎn)建立空間坐標(biāo)系，在垂直軸、矢狀軸、冠狀軸上以1cm為基本單位取空間坐標(biāo)點(diǎn)。腫瘤

2、標(biāo)本根據(jù)所取坐標(biāo)點(diǎn)依次切取組織塊，所有組織塊均用10％福爾馬林液固定，石蠟包埋。應(yīng)用所有石蠟包埋的組織塊制作組織芯片，芯片上每點(diǎn)直徑1.0mm，點(diǎn)間距0.5 mm。每個(gè)腫瘤制作一個(gè)芯片矩陣，矩陣中每點(diǎn)代表一個(gè)石蠟包埋的組織塊。組織芯片5μm厚切片，應(yīng)用免疫組化技術(shù)，VEGF多克隆抗體標(biāo)記VEGF，CD34單克隆抗體標(biāo)記微血管，檢測(cè)芯片上每個(gè)腫瘤組織點(diǎn)VEGF的表達(dá)，計(jì)數(shù)MYD，計(jì)算VEGF陽(yáng)性目標(biāo)積分光密度。參考Ma及孟悛非等對(duì)骨與軟組

3、織腫瘤邊緣與中心區(qū)域的定義，把骨肉瘤標(biāo)本所有點(diǎn)分為3組。取腫瘤的最大內(nèi)切圓的圓心(O)作為其中心，在病灶邊緣任意取點(diǎn)A～G，自O(shè)向病灶邊緣各點(diǎn)作放射狀連線，然后取每條線段的中內(nèi)1/3點(diǎn)、中外1/3點(diǎn)，將每條線段等分為3份。分別連接中內(nèi)l/3點(diǎn)、中外1/3點(diǎn)，形成大小不等的、與腫瘤外形相似的同心圓，將病灶分為3個(gè)部分，其中內(nèi)側(cè)部為腫瘤的內(nèi)層，外側(cè)部為腫瘤的外層，兩層之間的部分為腫瘤的中層。即將腫瘤所有點(diǎn)分為內(nèi)層、中層、外層3組。內(nèi)層代表腫

4、瘤的“中心區(qū)域”，外層代表腫瘤的“邊緣區(qū)域”，中層代表二者交界區(qū)。 2.建立荷骨肉瘤裸鼠動(dòng)物模型：采用骨肉瘤細(xì)胞系MG-63，0.2ml細(xì)胞懸液(約1×106個(gè)細(xì)胞)/只注射到20只裸鼠腋背部皮下，一周后成瘤，二周后切取腫瘤。選取12個(gè)大小均(1.0s*1.0*1.0cm3)的移植瘤標(biāo)本切取8um厚冰凍切片，應(yīng)用免疫組化技術(shù)，VEGF多抗標(biāo)記VEGF，CD34標(biāo)記微血管，檢測(cè)VEGF表達(dá)，計(jì)數(shù)MVD。冰凍切片要求：按順序切片，標(biāo)

5、記清楚；標(biāo)本每隔1mm連續(xù)切取2-4張切片。每張CD34單抗、VEGF多抗標(biāo)記的冰凍切片均以其中心為原點(diǎn)左右上下移動(dòng)，每移動(dòng)1mm確定為一個(gè)空間坐標(biāo)點(diǎn)，并在顯微鏡下對(duì)該坐標(biāo)點(diǎn)拍照計(jì)算MVD、VEGF陽(yáng)性目標(biāo)積分光密度，最后將一個(gè)腫瘤的所有空間坐標(biāo)點(diǎn)還原成一個(gè)完整腫瘤標(biāo)本，每個(gè)坐標(biāo)點(diǎn)代表腫瘤的不同空間位置，對(duì)每個(gè)點(diǎn)進(jìn)行分析時(shí)除外腫瘤壞死組織。參考等對(duì)骨與軟組織腫瘤邊緣與中心區(qū)域的定義，把移植瘤標(biāo)本分為2組。以腫瘤的中心為圓心(O)，以5m

6、m為直徑的圓形區(qū)域以?xún)?nèi)為腫瘤內(nèi)層，圓形區(qū)域以外為腫瘤外層。即將腫瘤劃分為內(nèi)層、外層2組。內(nèi)層代表腫瘤的“中心區(qū)域”，外層代表腫瘤的“邊緣區(qū)域”。上述圖像數(shù)據(jù)分析均采用MoticMed6.0圖像處理軟件，包括微血管密度計(jì)數(shù)(MVD)，VEGF表達(dá)的量化值(陽(yáng)性目標(biāo)積分光密度)。 結(jié)果： 1.3個(gè)人骨肉瘤標(biāo)本分析結(jié)果一致，即外層與中層VEGF表達(dá)、MVD分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，內(nèi)層與外層、中層之間VEGF表達(dá)、

7、MVD分布差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。人骨肉瘤瘤體邊緣區(qū)域的VEGF表達(dá)、MVD均高于腫瘤中心區(qū)域。在骨肉瘤瘤體內(nèi)層、中層與外層VEGF表達(dá)與MVD均呈正相關(guān)，即瘤體外層、中層VEGF表達(dá)高微血管分布較多，內(nèi)層VEGF表達(dá)低微血管分布較少。 2.骨肉瘤移植瘤標(biāo)本分析結(jié)果為，移植瘤外層、內(nèi)層之間VEGF表達(dá)、MVD分布差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。瘤體邊緣區(qū)域(或外周)VEGF表達(dá)及MVD均高于中心區(qū)域(或內(nèi)

8、部)。在瘤體內(nèi)層外層VEGF表達(dá)與MVD均呈正相關(guān)，即瘤體外層VEGF表達(dá)高微血管分布較多，內(nèi)層VEGF表達(dá)低微血管分布較少。 結(jié)論：人體骨肉瘤和荷人骨肉瘤裸鼠皮下移植瘤的瘤體內(nèi)，不同區(qū)域的VEGF表達(dá)和MVD的分布存在差異。在臨床上對(duì)骨肉瘤標(biāo)本送病理時(shí)，即使腫瘤中心區(qū)域沒(méi)有壞死，也應(yīng)取材腫瘤邊緣組織，以有利于腫瘤的病理學(xué)分析；在對(duì)骨肉瘤標(biāo)本進(jìn)行腫瘤血管生成的相關(guān)研究時(shí)，應(yīng)標(biāo)明取材部位，避免因瘤體內(nèi)部微血管的分布差異而引起的實(shí)驗(yàn)