shRNA介導(dǎo)的RNA干擾對兔角膜基質(zhì)細胞COX-2表達的抑制作用研究.pdf

1、目的：探討針對環(huán)氧化酶-2(COX-2)的RNA干擾(RNAi)對兔角膜基質(zhì)細胞中COX-2及基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)表達的影響。 方法：體外培養(yǎng)兔角膜基質(zhì)細胞，測定陽離子脂質(zhì)體HiperFect TransfectionReagent介導(dǎo)的siRNA在兔角膜基質(zhì)細胞中的轉(zhuǎn)染率，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。設(shè)計并合成3條針對兔COX-2基因的短發(fā)卡RNA(shRNA-1，2，3)和一條陰性對照shRNA。利用24孔板接種兔角膜基質(zhì)細胞

2、，隨機分為A、B、C、D、E、F六組，每組各10個孔，每個孔中接種細胞數(shù)目約為6×10<'-4>。A組為空白對照組，B、C、D、E、F為實驗組，其中B組接種細胞后36小時每ml培養(yǎng)液加入25ng IL-1α，C、D、E、F組接種細胞后24小時每個細胞孔(含0.5ml無血清DMEM培養(yǎng)液)內(nèi)加入3.0μl HiPerFectTransfection Reagent和25nM不同shRNA(分別為shRNA-1、shRNA-2、shRNA-

3、3及陰性對照shRNA)的稀釋混合物，12小時后每ml培養(yǎng)液再加入25ng IL-1α。在IL-1α處理6h、12h、24h、48h、72h時隨機選取每組中兩個培養(yǎng)孔的細胞，提取RNA，實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-Time PCR)檢測兔角膜基質(zhì)細胞中COX-2和MMP-2基因的表達，并與對照組進行比較。 結(jié)果： HiperFect Transfection Reagent能夠有效介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的兔角膜基質(zhì)細

4、胞，轉(zhuǎn)染率可達70-80％。IL-1α刺激后兔角膜基質(zhì)細胞中COX-2及MMP-2mRNA的表達較空白對照組顯著升高，并呈現(xiàn)時間依賴性；在不同的時間點，生物合成的三條針對COX一2的靶向shRNA中shRNA-2能顯著抑制IL-1α刺激后的兔角膜基質(zhì)細胞中COX-2、MMP-2 mRNA表達，抑制率最高可分別達83.04％、73.69％，與單純IL-1α刺激組相比差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；而shRNA-1、shRNA-3轉(zhuǎn)