靶向HIV和AIV包膜蛋白跨膜亞基的病毒進入抑制劑研究.pdf

1、艾滋病和禽流感成為當今中國乃至全世界有深遠影響的重大流行疾病，是當前人類健康面臨的重大威脅，但一直以來缺乏有效的治療藥物和疫苗。與SARS冠狀病毒（SARS-CoV）相似，人類免疫缺陷病毒（HIV）和禽流感病毒（AIV）均為Ⅰ型包膜病毒，采用相似的病毒-宿主細胞膜融合機制，即病毒表面糖蛋白結合到宿主細胞受體后，啟動病毒融合蛋白的一系列構象變化。包膜病毒進入靶細胞的過程需要病毒膜糖蛋白的介導，這一類型病毒的包膜蛋白一般都具有兩個亞基，其中

2、不跨膜的亞基（如HIV的gp120、AIV的HA1等）具有與靶細胞膜上病毒受體相結合的位點，而跨膜亞基（如HIV的gp41、AIV的HA2等）則介導病毒膜與靶細胞膜的融合。以上述研究為基礎設計的病毒進入抑制劑，可以在病毒包膜糖蛋白中間體構象形成的短時間內，高效、特異地競爭結合其配體，從而阻止包膜糖蛋白的進一步折疊，達到抑制病毒入侵的目的，為病毒疾病的防治提供了新思路和策略。 HIV是一種感染人類免疫系統(tǒng)細胞的慢病毒，主要感染CD

3、4+T淋巴細胞，特征性的引起CD4+T細胞逐步減少和進行性免疫缺陷，最后導致艾滋?。ǐ@得性免疫缺陷綜合征），引起機會性感染并最終導致死亡。病毒與宿主免疫細胞的相互作用是影響疾病發(fā)展的重要因素。在HIV感染導致的AIDS疾病進展過程中，T細胞活化是一把雙刃劍。一方面CD4+T細胞的活化在清除病毒過程是非常必要的，成熟的CD4+Th細胞是抗病毒免疫的關鍵因素。另一方面，HIV膜蛋白（Env）能結合CD4+受體，在CD4+T細胞中復制，由于病

4、毒顆粒的持續(xù)表達，HIV感染導致T細胞增殖增加，T細胞活化后又可借助自身表達的凋亡受體與配體的結合，使已發(fā)生特異性克隆擴增的T細胞發(fā)生自身凋亡而數量下降。因此，適度的T細胞活化可能作為HIV治療的一種方法和策略。 為此，本課題根據在HIV和SARS病毒進入抑制劑研究領域積累的經驗，以AIV和HIV作為研究對象，為研究AIV病毒進入抑制劑和HIV殺微生物劑奠定研究基礎。 （1）靶向H5N1禽流感病毒血凝素亞基HA2的病毒進

5、入抑制劑研究：建立抑制H5N1型AIV六螺旋束結構和N-端帽子結構形成的高通量篩選模型，并建立H5N1型禽流感假病毒模型，篩選小分子化合物庫，再利用活病毒感染MDCK模型和活病毒感染小鼠模型，驗證篩選出的小分子化合物的抗病毒活性，尋找能有效抑制H5N1型AIV進入靶細胞，且具有良好膜通透性的活性分子，為開發(fā)抗禽流感病毒進入抑制劑類藥物奠定基礎。 （2）抗HIV多肽VIR576對抗原特異性T細胞活化的影響：采用T細胞活化的檢測方法

6、，研究VIR576對抗原特異性T細胞活化的影響和作用機制。由于HIV感染與T細胞關系密切，研究將有助于初步探討VIR576與T細胞的關系，并分析其對HIV病毒感染的可能影響，有助于評價VIR576作為抗HIV殺微生物劑的可能性和機制。 第一部分、靶向H5N1禽流感病毒血凝素亞基HA2的病毒進入抑制劑研究。 目的： 建立抑制H5N1型AVI六螺旋束結構和N-端帽子結構形成的高通量篩選方法，并建立H5N1型禽流感假病

7、毒模型，篩選小分子化合物庫，得到小分子抗AIV化合物，再利用H5N1型活病毒感染MDCK模型和H5N1型活病毒感染小鼠模型進行驗證，尋找能有效抑制H5N1型AIV感染的活性分子，研究其抗禽流感的作用。 方法： 1.合成衍生于H5N1高致病性禽流感病毒血凝素亞基HA2的多肽，包括N-多肽（N29，aa77～aa105）、C-多肽（C19，aa110～aa128）以及用FITC標記的熒光C-多肽、生物素標記的N-末端帽子多肽

8、（N8，aa34～aa37）、FITC標記的C-末端帽子多肽（C8，aa173～aa176）。通過FLISA、熒光天然凝膠電泳、分子篩高效液相色譜等方法研究兩組多肽間的相互作用，嘗試建立阻止六螺旋束結構形成的熒光高通量篩選方法、抑制N-端帽子形成的高通量篩選方法、阻止六螺旋束結構形成的熒光天然凝膠電泳和分子篩高效液相色譜。 2.建立細胞水平的H5N1型禽流感假病毒活性檢測方法：禽流感病毒（Avian influenza viru

9、s，AIV）的包膜蛋白有兩個，分別為血凝素（Hemagglutinin，HA）和神經氨酸酶（Neuraminidase，NA），將表達這兩個包膜蛋白的質粒與pNL43-Luc.R-E-（帶有熒光素酶報告基因的HIV-1基因）共轉染至293 T細胞后，細胞表達禽流感病毒包膜蛋白（HA、NA）和HIV-1顆粒，它們可被組裝成為HA-NA/HIV假病毒，用來篩選作用于禽流感病毒包膜蛋白的化合物。 3.抗流感藥物活性驗證：應用H5N1型

10、活病毒感染MDCK細胞模型和H5N1型活病毒感染Balb/c鼠模型進行活性驗證，檢測藥物對病毒感染的MDCK細胞的保護作用及對MDCK細胞的毒性（CPE觀察及XTT法檢測）、藥物對病毒感染動物的死亡保護作用等，評價抗流感病毒新藥。即XTT法檢測藥物對MDCK細胞的毒性，CPE法（細胞病變）檢測藥物對流感病毒感染的MDCK細胞的保護作用，流感病毒對小鼠半數致死量（LD50）的測定和藥物對流感病毒感染小鼠的死亡保護試驗。 4.建立小

11、鼠血漿中ARC-36的HPLC檢測方法，研究ARC-36在小鼠體內的藥代動力學，考察小鼠腹腔注射ARC-36的急性毒性。 結論： 1.人工合成的衍生于H5N1高致病性禽流感病毒血凝素亞基HA2的多肽沒有抑制H5N1禽流感的活性。采用FLISA、圓二色譜、熒光天然凝膠電泳、分子篩高效液相色譜等技術發(fā)現，各組多肽之間沒有相互作用，無法建立抑制H5N1型AVI六螺旋束結構和N-端帽子結構形成的高通量篩選方法。 2.建立

12、的假病毒體系HA-NA/HIV可高效感染多種細胞系，篩選出的化合物ARC-36抑制H5N1禽流感假病毒活性較高，且作用于病毒進入階段。 3.ARC-36對H5N1型禽流感病毒有較強的抑制作用，且ARC-36滴鼻或腹腔注射均可以延長小鼠的存活時間，但對小鼠存活率沒有明顯的保護作用，可能原因是ARC-36的半衰期較短。 4.本實驗建立的小鼠血漿中ARC-36的HPLC測定法操作簡便、快速、準確，可用于ARC-36的體內定量分

13、析。小鼠腹腔靜脈注射ARC-36后血漿C-t曲線呈二室模型，ARC-36在血中清除迅速。小鼠腹腔注射ARC-36具有一定的安全性。 第二部分、抗HIV多肽VIR576對抗原特異性T細胞活化的影響及機制研究。 目的： 采用T細胞活化的檢測方法，研究VIR576對抗原特異性T細胞活化的作用，探討其對T細胞活化及HIV免疫的影響；并用生物物理等方法研究VIR576與TCR-TMD之間的相互作用，評價VIR576作為HI

14、V殺微生物劑的可能性和機制。 方法： 1.MOG35-55體外刺激抗原特異性T細胞系A2b細胞，[3H]脫氧胸苷攝入法測定VIR576對A2b細胞活化的影響；OVA體外刺激分離的DO11.10小鼠抗原特異性T細胞，CCK-8法測定VIR576對其活化的影響；刀豆蛋白（ConA）或抗鼠CD3抗體體外刺激非抗原特異性小鼠T細胞，CCK-8法測定VIR576對其活化的影響；采用免疫磁珠兩步法分離小鼠脾組織CD4+CD25-T細

15、胞，CCK-8法測定VIR576對其活化的影響。 2.用溶血試驗、溶血抑制實驗、FRET、FLISA、競爭性FLISA等方法檢測VIR576與TCR-TMD之間的相互作用，并研究其主要的結合區(qū)域。多肽TCR-TMD加入到人紅細胞懸液，在405 nm處測吸光度，考察多肽TCR-TMD的插膜作用；多肽VIR576或VIR-scram與多肽TCR-TMD孵育后加入到人紅細胞懸液，考察其對多肽TCR-TMD插膜作用的抑制作用。TCR-T

16、MD包被到96孔酶標板里，加入相應濃度的Rho-VIR576，；或者加入Rho-VIR576和未標記的VIR576，讀取各孔熒光密度值，考察TCR-TMD與VIR576之間的相互作用。用FRET技術考察TCR-TMD的核心序列CP與VIR576的相互關系，將CP-NBD加入到LUV溶液，在467 nm波長激發(fā)，500 nm-600 nm波長發(fā)射，再加入Rho-VIR576，考察其能量轉移（FRET）。 3.BALB/c小鼠脾細胞

17、用抗鼠-CD3抗體刺激72小時后，4%多聚甲醛冰上固定，加入1：50稀釋的兔抗鼠CD4抗體，再加入1：50稀釋的標記的羊抗兔IgG，在孵育的最后5 min加入Rho-VIR576。細胞用PBS洗三次，在激光共聚焦顯微鏡下觀察VIR576在T細胞細胞膜的定位和與TCR分子的共分布情況。 結論： 1.VIR576能抑制抗原特異性T細胞活化，也能反轉FP介導的抗原特異性T細胞活化，但對非抗原特異性T細胞活化沒有作用。