凍融人胎兒卵巢組織異種移植的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的 卵巢冷凍和移植的實(shí)驗(yàn)研究開(kāi)始于上世紀(jì)50年代，半個(gè)世紀(jì)以來(lái)的研究表明卵巢組織的冷凍保存和移植能恢復(fù)由于化療、放療或手術(shù)而面臨卵巢早衰的女性的生殖能力。有研究證明猴、貓和成人的卵巢組織異種移植到免疫缺陷鼠體內(nèi)有正常竇卵泡的生長(zhǎng)，但胎兒卵巢組織中的卵母細(xì)胞是否與成人卵細(xì)胞具有相同發(fā)育能力的研究甚少。因此我們進(jìn)行了以裸鼠為受體的凍融人胎兒卵巢組織的異種移植，從光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡、凋亡及增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)等方面進(jìn)行評(píng)價(jià)，探討移

2、植后卵泡生長(zhǎng)發(fā)育的情況，為凍融人胎兒卵巢組織作為潛在供體和臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法 實(shí)驗(yàn)分為四組：新鮮組、凍融組、移植腎臟組和移植肌肉組，新鮮的胎兒卵巢組織為新鮮組，慢凍一快融的胎兒卵巢組織為凍融組，移植腎臟組和移植肌肉組的處理如下：凍融的胎兒卵巢組織異種移植到24只去勢(shì)裸鼠的腎被膜下／背部?jī)蓚?cè)肌肉中。2個(gè)月后開(kāi)始隔天注射5IU的PMSG，持續(xù)5侖月。注射5IU的HCG36小時(shí)后獲取移植物。將所有胎兒卵巢組織石蠟包埋

3、后5um連續(xù)切片，進(jìn)行光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡、凋亡(Tunel)和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的檢測(cè)。 結(jié)果 一、新鮮組與凍融組的檢測(cè) 1、光學(xué)顯微鏡觀察：新鮮組和凍融組中絕大多數(shù)是原始卵泡，與新鮮組相比，凍融組正常及總的原始卵泡數(shù)雖有所下降，異常原始卵泡數(shù)稍有升高，但兩組間無(wú)顯著性差異。 2、電子顯微鏡觀察：與新鮮組相比，凍融組卵巢組織中細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)大部分保存良好。冷凍損傷在卵母細(xì)胞主要表現(xiàn)為胞漿內(nèi)的空

4、泡，線(xiàn)粒體水腫，偶見(jiàn)核膜的皺縮；在顆粒細(xì)胞主要為輕度的水腫和少量空泡；間質(zhì)組織未見(jiàn)明顯損傷。 3、凋亡的檢測(cè)：分別觀察原始卵泡223和179個(gè)，凋亡卵泡數(shù)分別為5和7個(gè)，凋亡率分別為0．02％和O．04％。凋亡大多發(fā)生在卵母細(xì)胞，偶為顆粒細(xì)胞的凋亡。 4、PCNA的檢測(cè)：分別觀察原始卵泡125和109個(gè)，均未見(jiàn)有PCNA的陽(yáng)性表達(dá)。 二、移植腎臟組和移植肌肉組的檢測(cè) 1、動(dòng)物生存及移植物的回收：裸鼠生存率

5、為83．3％，移植腎臟組和移植肌肉組的移植物回收率分別為60．0％和25．0％。 2、光學(xué)顯微鏡：兩組中均以原始卵泡為主，可見(jiàn)各級(jí)卵泡及閉鎖的竇卵泡。移植腎臟組中(單位切片數(shù))初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡及竇卵泡數(shù)均多與移植肌肉組。兩組每高倍鏡視野下的原始卵泡數(shù)相比無(wú)顯著性差異，與新鮮組和凍融組相比明顯減少。 3、凋亡的檢測(cè)：兩移植組中均未見(jiàn)原始卵泡的凋亡，初級(jí)和次級(jí)卵泡表現(xiàn)為數(shù)個(gè)顆粒細(xì)胞的凋亡。間質(zhì)中偶見(jiàn)細(xì)胞的凋亡。 4

6、、PCNA的測(cè)定結(jié)果：兩移植組原始卵泡中除數(shù)個(gè)立方形前顆粒細(xì)胞外，無(wú)PCNA陽(yáng)性表達(dá)。PCNA陽(yáng)性表達(dá)主要為初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡和竇卵泡的顆粒細(xì)胞和／或卵母細(xì)胞。卵巢間質(zhì)也有大量PCNA的陽(yáng)性表達(dá)。 結(jié)論 1、冷凍后人胎兒卵巢組織的原始卵泡無(wú)明顯減少，且形態(tài)結(jié)構(gòu)保存良好；超微結(jié)構(gòu)的損傷主要為線(xiàn)粒體的水腫和胞漿內(nèi)空泡；卵泡凋亡的表達(dá)較低與新鮮胎兒卵巢組織相似，這些都證明慢速冷凍法適合人胎兒卵巢組織的保存。 2、人胎兒