自噬在胰高血糖素樣肽-1干預肝細胞單純性脂肪變性中的作用研究.pdf

1、研究背景:
　　非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD)是指在無過多酒精攝入同時排除病毒性、藥物性、全胃腸外營養(yǎng)、先天性及自身免疫性等損肝因素的前提下出現(xiàn)肝細胞內(nèi)脂質沉積，包括一系列病變，從單純性脂肪肝(simple hepatic steatosis)到非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)，后者可進一步發(fā)展為肝纖維化、

2、肝硬化，甚至是肝細胞癌。隨著西方生活方式的流行和生活水平的提高，NAFLD發(fā)病率逐年上升。因此NAFLD已經(jīng)成為危害健康的重大衛(wèi)生問題。
　　既往認為單純性脂肪肝階段為良性病變，所以對其防治不夠重視。然而研究發(fā)現(xiàn)約20％的單純性脂肪肝患者可以發(fā)展成NASH;與正常肝臟相比，單純性脂肪肝階段的肝臟較易受到藥物、工業(yè)毒物、酒精、缺血以及病毒感染等傷害，導致其他類型肝病發(fā)生;單純性脂肪肝可以加重胰島素抵抗和代謝紊亂;單純性脂肪肝也是糖尿

3、病進展、動脈粥樣硬化加重和血管功能失調的獨立危險因子。因此積極干預單純性脂肪肝對NAFLD的早期防治意義重大。
　　然而NAFLD的發(fā)病機制目前尚未完全闡明，故治療尚停留在減少危險因素及飲食、運動的干預，缺乏特別有效的藥物治療。胰高血糖素樣肽-1(Glucagon-Like Peptide-1，GLP-1)由小腸L細胞分泌，具有葡萄糖依賴性的促胰島素分泌作用，同時還有增加飽腹感、減慢胃排空、減輕體重及促進胰島β細胞增殖等作用。目前

4、的研究發(fā)現(xiàn)人類肝細胞上存在GLP-1的受體，并且GLP-1能夠降低肝細胞內(nèi)的脂質沉積。但GLP-1是否能夠在單純性肝細胞脂肪變性階段起作用及其作用機制如何，尚需進一步研究。
　　自噬(Autophagy)是真核細胞中普遍存在的一種物質降解途徑，通過自噬-溶酶體介導，清除自身多余的蛋白質以及受損的細胞器，促進細胞內(nèi)物質的循環(huán)利用，從而維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。最近的研究表明自噬參與脂質的降解。GLP-1類似物能夠減輕脂肪酸誘導的肝細胞脂質沉積

5、，與自噬相關的標志物Beclin-1和LC3B-Ⅱ生成增加，電鏡觀察到自噬體數(shù)量增加。由此推測自噬很可能參與了GLP-1減輕肝細胞脂質沉積的過程，但自噬是否在單純性脂肪肝的發(fā)生發(fā)展中起作用尚需進一步的研究。
　　第一部分肝細胞單純性脂肪變性模型的構建及鑒定
　　目的:構建肝細胞單純性脂肪變性模型，然后進行鑒定以判斷能否模擬人體單純性脂肪肝的病理特點。
　　方法:常規(guī)10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)人正常肝細胞系L-02

6、細胞，待細胞融合度達70-80％時進行消化傳代。然后正常組換用新鮮的完全培養(yǎng)基，模型組換用含1mmol/L游離脂肪酸混合物（油酸∶棕櫚酸=2∶1）的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時，分別進行油紅O染色、細胞內(nèi)甘油三酯測定評價細胞內(nèi)脂質沉積情況，CCK-8法檢測細胞活力，細胞內(nèi)丙二醛測定評價氧化應激情況，Hoechst33342染色、AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色法流式細胞檢測及Western blot檢測cleaved caspas

7、e-3蛋白的表達以比較兩組細胞的凋亡情況。
　　結果:油紅O染色顯示模型組細胞內(nèi)可見大量紅色脂滴形成，而正常組未見明顯脂滴形成。細胞內(nèi)甘油三酯測定證實模型組細胞內(nèi)甘油三酯含量明顯高于正常組(p＜0.01)。兩組在細胞活力、氧化應激方面均無明顯差異。Hoechst33342染色結果表明兩組細胞凋亡均不明顯。AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色法流式細胞檢測結果顯示兩組細胞的早期凋亡比例無顯著性差異。Westernblot檢測顯示兩

8、組細胞cleaved caspase-3的蛋白表達水平均很低。
　　小結:使用含1mmol/L游離脂肪酸混合物（油酸∶棕櫚酸=2∶1）的完全培養(yǎng)基誘導L-02細胞24小時能夠構建類似人單純性脂肪肝病理改變的肝細胞單純性脂肪變性模型。
　　第二部分自噬在GLP-1干預肝細胞單純性脂肪變性中的作用
　　目的:觀察利拉魯肽（GLP-1長效類似物）干預對肝細胞單純性脂肪變性細胞模型脂質沉積的影響及自噬在這一過程中的作用。

9、>　　方法:取L-02細胞常規(guī)培養(yǎng)24小時后更換培養(yǎng)基并加入適當體積的注射用水，繼續(xù)培養(yǎng)24小時，作為正常組。另外按照第一部分方法構建肝細胞單純性脂肪變性模型，然后分為5組:模型組、利拉魯肽10nM組、利拉魯肽100nM組、利拉魯肽100nM+3-Methyladenine（3-MA，3-甲基腺嘌呤，自噬抑制劑）組、雷帕霉素(Rapamycin，自噬增強劑)組，并依次給予相應的處理，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。取上述6組細胞，分別進行油紅O染色、

10、細胞內(nèi)甘油三酯測定評價細胞內(nèi)脂質沉積程度的變化，RT-PCR、Western blot檢測細胞內(nèi)Beclin-1、p62、LC3B的mRNA和蛋白水平的變化，電鏡觀察細胞內(nèi)自噬體情況。
　　結果:1.油紅O染色顯示利拉魯肽干預后，細胞內(nèi)脂滴數(shù)量較模型組明顯減少，其中100nM組更為明顯。同時使用利拉魯肽100nM和自噬抑制劑3-MA進行干預時，細胞內(nèi)的脂滴數(shù)量較單獨使用利拉魯肽100nM增加，但仍較模型組少。自噬增強劑雷帕霉素干預

11、同樣能夠減少細胞內(nèi)的脂滴數(shù)量。細胞內(nèi)甘油三酯測定的結果與油紅O染色結果基本一致。
　　2.RT-PCR的結果表明各組Beclin-1 mRNA表達水平無明顯差異。P62mRNA表達水平在各組（除正常組外）間無明顯差異。模型組LC3BmRNA表達水平低于正常組，但沒有明顯差異。利拉魯肽10nM組、100nM組LC3B mRNA表達水平均高于模型組，其中100nM組有顯著性差異(p＜0.05)。而利拉魯肽100nM+3-MA組LC3B

12、 mRNA表達水平明顯低于利拉魯肽100nM組(p＜0.05)。雷帕霉素干預后LC3B mRNA表達水平明顯高于模型組(p＜0.05)。Western blot檢測各組Beclin-1、p62以及LC3BⅡ的蛋白表達水平，結果顯示與RT-PCR變化大體一致。使用Bafilomycin阻斷自噬體和溶酶體的融合，通過比較阻斷前后LC3BⅡ蛋白表達量的變化來觀察各組自噬潮的大小，結果顯示:模型組低于正常組，利拉魯肽100nM組明顯高于模型組，

13、而利拉魯肽100nM+3-MA組低于利拉魯肽100nM組，仍高于模型組。雷帕霉素組明顯高于模型組。
　　3.電鏡觀察顯示正常組L-02細胞內(nèi)可見較多線粒體，少量自噬體。模型組細胞內(nèi)見大量脂質空泡，未見自噬體。利拉魯肽100nM組細胞內(nèi)脂質空泡較少，見大量自噬體。而利拉魯肽100nM+3-MA組細胞內(nèi)自噬體數(shù)量較少，脂質空泡較多，有融合成片現(xiàn)象。雷帕霉素組細胞內(nèi)見較多自噬體和少量脂質空泡。
　　小結:利拉魯肽能夠減輕肝細胞單純

14、性脂肪變性細胞模型的脂質沉積，并且有一定的劑量依賴性。利拉魯肽減輕肝細胞脂質沉積的過程中存在自噬增強的現(xiàn)象，而抑制自噬可使利拉魯肽減輕肝細胞脂質沉積的作用減弱。單獨增強自噬也能減輕肝細胞脂質沉積。由此推測自噬可能是利拉魯肽減輕肝細胞單純性脂肪變性模型脂質沉積的機制之一。
　　全文結論
　　1.使用1mmol/L游離脂肪酸混合物（油酸∶棕櫚酸=2∶1）誘導人正常肝細胞系L-02細胞24小時，能夠構建類似人單純性脂肪肝病理改變的