NMDA受體活化Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)通路RBMECs高表達(dá)P-gp中的機(jī)制初探.pdf

1、第一部分谷氨酸誘導(dǎo)RBMECs高表達(dá)P-gp模型的建立及NMDA受體抑制劑對(duì)P-gp表達(dá)影響的觀察
　　目的:建立谷氨酸誘導(dǎo)RBMECs高表達(dá)P-gp的模型，了解NMDA受體抑制劑在該模型中對(duì)P-gp表達(dá)的影響。
　　方法:選取新生1-2天Wistar大鼠，斷頭取腦，去除腦膜、大血管以及纖維結(jié)締組織以及神經(jīng)元細(xì)胞，保留微血管內(nèi)皮細(xì)胞，以高糖DMEM+bFGF培養(yǎng)液培養(yǎng)10天至鋪滿培養(yǎng)皿，給予一定濃度的谷氨酸作用，MTT法測(cè)定

2、細(xì)胞活力，并確定合適的谷氨酸濃度，分為MK801+Glu組、Glu+PBS組以及Control對(duì)照組，以RT-qPCR檢測(cè)各組Mdr1a、Mdr1 b、Mrp2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平，Western Blot法檢測(cè)P-gp、MRP2表達(dá)水平。
　　結(jié)果:本部分研究發(fā)現(xiàn)100μmol/L谷氨酸作用使得RBMECs細(xì)胞活力＞95％。Glu+PBS組Mdr1a、Mdr1b mRNA在1h、3h、6h時(shí)間點(diǎn)表達(dá)水平高于對(duì)照組，P-gp在3h、

3、6h、24h、72h時(shí)間點(diǎn)表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組。MK801+Glu組Mdr1a、Mdrb表達(dá)水平在3h時(shí)間點(diǎn)時(shí)明顯低于Glu+PBS組，P-gp24h時(shí)間點(diǎn)表達(dá)水平明顯低于Glu+PBS組。
　　結(jié)論:100μ mol/L谷氨酸刺激RBMECs使得Mdr1a、Mdr1b mRNA轉(zhuǎn)錄水平升高。本部分研究成功制備了谷氨酸刺激RBMECs高表達(dá)P-gp的細(xì)胞模型。NMDA受體抑制劑MK801可以顯著降低谷氨酸RBMECs Mdr1a

4、、Mdr1b mRNA轉(zhuǎn)錄水平以及P-gp表達(dá)水平。
　　第二部分谷氨酸誘導(dǎo)NMDA受體活化信號(hào)通路中關(guān)鍵調(diào)控因子的活化檢測(cè)
　　目的:檢測(cè)谷氨酸信號(hào)傳導(dǎo)通路關(guān)鍵調(diào)控因子及其下游轉(zhuǎn)錄或延長(zhǎng)因子的活化程度，進(jìn)一步研究耐藥調(diào)控機(jī)制，并選取合適的實(shí)驗(yàn)干預(yù)位點(diǎn)。
　　方法:選取新生1-2天Wistar大鼠，保留腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，并以高糖DMEM+bFGF培養(yǎng)液培養(yǎng)10天至鋪滿培養(yǎng)皿，分為MK801+Glu組、Glu+PBS組以

5、及Control對(duì)照組，以Western Blot法檢測(cè)eEF-2K表達(dá)水平、eEF-2表達(dá)水平以及磷酸化水平、NF-κ B表達(dá)水平，ELISA法檢測(cè)NF-κB(p65)活化程度。
　　結(jié)果:Glu+PBS組6h、24h、72h eEF-2K表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，Glu+PBS組5min、1h eEF-2磷酸化水平明顯高于對(duì)照組。MK801+Glu組6h、24h、72h時(shí)間點(diǎn)eEF-2K表達(dá)水平均低于Glu+PBS組，5min、

6、1h、3h eEF-2磷酸化水平亦低于Glu+PBS組，并與P-gp表達(dá)水平相一致。Glu+PBS組1h、3h時(shí)間點(diǎn)NF-κB(p65)活化水平較對(duì)照組明顯增高，Glu+PBS組在1h、3h、6h、24h時(shí)間點(diǎn)Mdr1a轉(zhuǎn)錄水平較對(duì)照組明顯增高。MK801+Glu組1h、3h時(shí)間點(diǎn)NF-κB(p65)活化水平僅略低于Glu+PBS組，而6h、24h時(shí)間點(diǎn)NF-κ B表達(dá)水平略高于Glu+PBS組。
　　結(jié)論:谷氨酸NMDA受體活化

7、引起eEF-2K蛋白表達(dá)水平升高、eEF-2磷酸化水平的升高以及P-gp高表達(dá)，提示NMDA受體活化后可能通過(guò)Ca2+-CaM-eEF-2K-eEF-2信號(hào)通路參與P-gp表達(dá)調(diào)控。NMDA受體抑制劑MK801抑制NMDA受體活化所引起的eEF-2K高表達(dá)、eEF-2高磷酸化水平以及P-gp高表達(dá)，提示對(duì)NMDA受體進(jìn)行干預(yù)可能通過(guò)下游激酶eEF-2K及延長(zhǎng)因子eEF-2參與對(duì)P-gp的表達(dá)調(diào)控。谷氨酸NMDA受體活化增加NF-κB活化

8、水平，提示NF-κB的活化可能參與NMDA受體激活引起的P-gp表達(dá)增高。MK801未明顯影響NF-κB活化水平增高，提示NMDA受體抑制劑可能無(wú)法終止NF-κ B的活化。
　　第三部分 eEF-2K干預(yù)劑對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)RBMECs高表達(dá)P-gp的調(diào)控作用及其機(jī)制研究
　　目的:通過(guò)對(duì)eEF-2K進(jìn)行干預(yù)以了解eEF-2K抑制劑對(duì)谷氨酸刺激RBMECs細(xì)胞模型P-gp表達(dá)水平的影響。觀察eEF-2K抑制劑NH125對(duì)下游eEF

9、-2的表達(dá)水平、磷酸化水平及P-gp表達(dá)水平的影響;了解應(yīng)用MK801、NH125對(duì)信號(hào)通路上下游同時(shí)進(jìn)行阻斷對(duì)P-gp表達(dá)水平的影響。
　　方法:選取新生1-2天Wistar大鼠，保留腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，并以高糖DMEM+bFGF培養(yǎng)液培養(yǎng)10天至鋪滿培養(yǎng)皿，MTT方法檢測(cè)eEF-2K抑制劑NH125各濃度作用下細(xì)胞活力，確定NH125合適的濃度，并分為NH125+Glu組、Glu+PBS組、NH125+PBS組、NH125+MK

10、801+Glu組、MK801+Glu組以及Control對(duì)照組，以RT-qPCR法檢測(cè)Mdr1a、Mdr1b mRNA轉(zhuǎn)錄水平，Western Blot法檢測(cè)eEF-2表達(dá)水平、磷酸化水平及P-gp表達(dá)水平。
　　結(jié)果:1μ mol/L NH125+Glu組1h、3h、6h時(shí)間點(diǎn)Mdr1a、Mdr1b mRNA相對(duì)表達(dá)量略低于Glu+PBS組。NH125+Glu組3h、6h時(shí)間點(diǎn)P-gp表達(dá)略低于Glu+PBS組，24h時(shí)間點(diǎn)P-

11、gp表達(dá)明顯低于NH125+PBS組。NH125+Glu組eEF-2表達(dá)水平與Glu+PBS組無(wú)顯著差異。NH125+Glu組在5min、1h時(shí)間點(diǎn)phospho-eEF-2表達(dá)明顯低于Glu+PBS組(P＜0.05)，3h時(shí)間點(diǎn)phospho-eEF-2表達(dá)略低于Glu+PBS組。NH125干預(yù)后6h、24h時(shí)間點(diǎn)P-gp表達(dá)顯著低于MKS01+glu組，3h時(shí)間點(diǎn)P-gp表達(dá)水平略低于MK801+glu組。NH125+MK801+G

12、lu組5min、1h、3h eEF-2磷酸化水平較MK801+Glu明顯降低。
　　結(jié)論:NH1251μ mol/L作為eEF-2K抑制劑可應(yīng)用于谷氨酸刺激RBMECs高表達(dá)P-gp細(xì)胞模型的研究。NH125能顯著降低谷氨酸刺激RBMECs細(xì)胞模型中P-gp表達(dá)水平。NH125作為eEF-2K的抑制劑能顯著降低eEF-2磷酸化水平，可能在肽鏈延長(zhǎng)階段對(duì)P-gp表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。NH125聯(lián)合MKS01干預(yù)可能通過(guò)降低eEF-2磷酸化水

13、平，較完全抑制谷氨酸刺激RBMECs高表達(dá)P-gp的效應(yīng)。
　　結(jié)論
　　1.創(chuàng)建了谷氨酸RBMECs誘導(dǎo)P-gp高表達(dá)的體外模型。
　　2.谷氨酸NMDA受體活化引起eEF-2K蛋白表達(dá)水平升高、eEF-2磷酸化水平的升高以及P-gp高表達(dá)，提示NMDA受體活化后可能通過(guò)Ca2+-CaM-eEF-2K-eEF-2信號(hào)通路參與P-gp表達(dá)調(diào)控。
　　3.NMDA受體抑制劑MK801可以抑制NMDA受體活化所引起的

14、eEF-2K高表達(dá)、eEF-2高磷酸化水平以及P-gp高表達(dá)，提示對(duì)NMDA受體進(jìn)行干預(yù)可能引起相應(yīng)信號(hào)通路的關(guān)鍵激酶以及延長(zhǎng)因子，達(dá)到對(duì)P-gp表達(dá)的調(diào)控。
　　4.谷氨酸NMDA受體活化增加NF-κB活化水平，給予NMDA受體抑制劑MK801未明顯影響NMDA受體活化所引起的NF-κ B活化水平增高，提示NMDA受體抑制劑可能無(wú)法終止NF-κ B的活化。
　　5.NH125能顯著降低谷氨酸刺激RBMECs P-gp高表達(dá)