第二代高通量測序分析VVC及BV患者陰道菌群多樣性.pdf

1、研究背景：
　　 陰道微生物群落對于維護陰道內環(huán)境穩(wěn)定，預防生殖道及泌尿道的感染非常重要，因此，明確陰道微生物群落的組成與動態(tài)變化對于我們理解這些疾病的發(fā)病和采取治療及預防措施無疑會幫助較大。
　　 以前，我們基本上是基于顯微鏡檢查和傳統(tǒng)培養(yǎng)法而獲得陰道微生物群落信息的認知?；竟J乳酸桿菌為陰道的優(yōu)勢菌群，其通過空間占位，營養(yǎng)競爭，產生乳酸、H2O2、生物素，刺激機體免疫功能等機制維持著陰道的酸性環(huán)境(3.8-4.2)

2、，抑制著陰道內其它菌群的生長。但是，由于陰道菌群眾多，其中一些很難通過傳統(tǒng)純培養(yǎng)和分離鑒定的方法得知。近年來隨著分子遺傳學和分子生物學技術的迅速發(fā)展，一些新方法的出現，給我們進一步明確陰道微生物群落組成帶來了可能。自聚合酶鏈反應技術(polymerase chain reaction，PCR)建立至今，該技術的發(fā)展十分的迅速，應用也在日趨的多元化?；?6S rRNA基因PCR擴增是目前最常用的檢測陰道微生物的非培養(yǎng)法，使得微生物的分類

3、鑒定從表型特征鑒定，深化為基因特征鑒定。隨著第二代高通量測序技術的發(fā)展，如Roche454高通量測序平臺和Illumina Solexa高通量測序平臺等，使得測序通量和準確性有了很大的提高，但由于成本因素，目前還僅僅局限在幾個小組運用。周宏偉等在第二代高通量Solexa測序平臺的基礎上，通過配對雙末端測序策略測定16S段片段，并融合條碼(barcode)技術，建立了BarcodedPaired-End Illumina Sequenci

4、ng（簡稱BIPES）法，從而使這一新的第二代高通量測序法具備了操作簡便，成本低廉，重現性好等優(yōu)點，讓臨床研究中簡便、快速獲得全面、系統(tǒng)、結構化的微生物群落結構信息成為可能。
　　 我們知道，外陰陰道假絲酵母菌病(VVC)與細菌性陰道病(BV)是臨床常見的兩種陰道炎性疾病，其發(fā)病均非源自外源性的微生物感染，而與陰道內自身微生物群落的構成及微環(huán)境變化有關，但是，對于其發(fā)病時和治療后，陰道內微生物種群究竟呈現何種變化，目前尚無定論。

5、本研究利用BIPES對健康育齡期女性、VVC患者、VVC近期治愈后患者及BV患者的陰道菌群進行檢測，以期在低成本的條件下對陰道菌群有更準確全面的認識，為進一步探討VVC及BV的病因及其治療與預防提供依據。
　　 方法：
　　 1.實驗對象與目的:
　　 實驗一:比較不同部位的菌落組成是否存在差異。隨機選取門診患者27例，年齡在21-47歲，中位年齡34歲，月經規(guī)律，知情同意后，用無菌陰道棉拭子于陰道穹窿及陰道下1

6、/3段各取兩管分泌物。
　　 實驗二:檢測VVC患者治療前后陰道微生物種群的構成狀況。①VVC組:初診共44例，年齡在20-45歲，中位年齡32歲。為2011年6月至2011年11月在南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院婦產科門診的患者。納入標準:符合高等學校教材第7版《婦產科學》診斷標準。②VVC近期治愈后組:VVC組患者給予以下方案治療:氟康唑150mg，口服，一日1次，連續(xù)4日;鹽酸特比萘芬陰道泡騰片一日1次，一次1粒，陰道上藥，連續(xù)7日

7、;除濕止癢洗液，坐浴，停藥10至14天后共有28例復診，均癥狀消失及陰道分泌物鏡檢念珠菌陰性。③正常對照組:共39例，為同期本院健康門診體檢育齡期婦女，年齡在21-49歲之間，中位年齡35歲。通過詳細病史詢問、陰道清潔度分級、陰道分泌物Nugent評分，納入標準為同時滿足以下三項:①無臨床癥狀;②陰道清潔度分級為Ⅰ-Ⅱ級;③Nugent評分在0～3分。
　　 實驗三:檢測BV患者陰道微生物種群的構成狀況。①BV組:共37例，年齡

8、在22-48歲，中位年齡34歲，為2012年01月至2012年03月在南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院婦產科門診的患者。納入標準:Amsel臨床診斷標準的4項內容，其中以發(fā)現線索細胞為必備項目+其他3項中的任意2項陽性，同時Nugent評分≥7分診斷為BV。②健康育齡期女性組:共37例。符合實驗二正常對照組的納入標準。
　　 以上各組均為我國漢族人，同時滿足以下條件:患者一月內無全身應用抗生素及陰道局部用藥史，3天內無性生活史，非妊娠期、哺

9、乳期或月經期，無糖尿病，沒有同時患有滴蟲性、或其它陰道炎癥。
　　 實驗二、三各組實驗對象知情同意后，用無菌陰道棉拭子于陰道穹窿取兩管分泌物。
　　 2.采用法醫(yī)DNA提取試劑盒（深圳易瑞）提取樣本總DNA，具體操作步驟參照說明書。
　　 3.16s rRNA V6區(qū)基因片段的擴增及Illumina測序:以樣本總DNA為模版，采用引物967F和1046R擴增其中的16S rRNA V6區(qū)基因。PCR產物以相等的終

10、濃度混合均勻，通過Illumina HiSeq2000平臺進行雙末端100bp測序（華大基因，深圳）。
　　 4.測得序列經過barcoded lllumina paired-end(PE) sequencing(BIPES)流程進行初步處理。使用TSC進行聚類，提取出每個操作分類單元(Operationaltaxonomy unit，OTU)的代表序列后利用GAST進行物種的分類，其中屬于乳酸菌屬的OTU利用megablast

11、進一步分到種級別，后續(xù)分析包括聚類分析，Alpha多樣性和beta多樣性分析。基于Unifrac距離，采用QIIME進行陰道菌群主成分分析。采用linear discriminant analysis(LDA) coupled with effect sizemeasurements(LEfSe)在線工具分析患者特殊的陰道菌群。
　　 結果：
　　 實驗一:
　　 1.陰道穹窿和陰道下1/3段分泌物的微生物群落趨

12、近于相同。
　　 實驗二:
　　 1.VVC患者的陰道菌群結構可分成四種類型:
　　 (1) VVC_Ⅰ型的陰道菌群以乳酸桿菌占優(yōu)勢（豐富度范圍95.4％～99.7％，平均98.5％），與健康育齡期女性陰道菌群相似，僅存在兩個乳酸桿菌菌種，惰性乳酸桿菌或者卷曲乳酸桿菌;
　　 (2) VVC_Ⅱ型仍以乳酸桿菌占優(yōu)勢，但豐度水平低于VVC_Ⅰ型。乳酸桿菌的豐富度范圍73.2％～93.8％，平均84.2％，V

13、VC_Ⅰ型和VVC_Ⅱ型之間的乳酸桿菌菌屬沒有統(tǒng)計學差異。全部VVC_Ⅱ型的樣品由惰性乳酸桿菌占優(yōu)勢，一些標本還存在小比例的卷曲乳酸桿菌，格氏乳桿菌或詹氏乳酸桿菌，VVC_Ⅱ型較VVC_Ⅰ型Alpha及beta多樣性明顯增加;
　　 (3) VVC_Ⅲ型樣品顯示較之前兩型更復雜的菌群信息，乳酸桿菌仍比較常見，但明顯不同于VVC_Ⅰ型，豐富度降低明顯，占18.9％～48.8％，平均33.9％。在這型惰性乳酸桿菌仍是常見的菌種，加德

14、納氏菌屬成為一個優(yōu)勢菌群，占24.3％～43.5％，平均33.9％;
　　 (4) VVC_Ⅳ型陰道菌群Alpha多樣性及beta多樣性明顯增加，乳酸桿菌降低至3.2％，甚至消失，大部以加德納氏菌屬占優(yōu)勢，顆粒鏈球菌屬、普氏菌菌屬、戴阿李斯特桿菌屬、厭氧球菌、纖毛菌屬、微單胞菌屬、動彎桿菌、丹毒絲菌屬等豐富度明顯增加。
　　 2.抗真菌治療后患者臨床癥狀消失，病原診斷陰性，但大部分陰道菌群都沒有像期待那樣恢復正常，個體差

15、異大，VVC_Ⅰ型治療前幾乎是正常的陰道菌群，復診的4位患者的加德納氏菌屬較治療前增加，其余6位陰道菌群變化不大。有2位來自VVC_Ⅱ型的復診患者，她們的陰道菌群以鏈球菌占優(yōu)勢，其余4位VVC_Ⅱ型的復診患者，治療后卷曲乳酸桿菌豐富度增加。VVC_Ⅲ型治療后加德納氏菌屬豐富度降低，惰性乳酸桿菌豐富度升高，但未恢復正常，僅有2例恢復正常。2位VVC_Ⅳ型的復診患者，加德納氏菌屬明顯減少，但陰道菌群也是以鏈球菌占優(yōu)勢。另外2位VVC_Ⅳ型的

16、復診患者，加德納氏菌屬豐富度減少，纖毛菌屬、普氏菌菌屬消失，也出現了少量的鏈球菌。
　　 實驗三:
　　 1.通過稀釋曲線、Observed OTU和Shannon多樣性指數對比顯示BV患者的陰道菌群Alpha多樣性較健康育齡期女性的明顯增加;
　　 2.通過PCoA Unifrac距離及primer聚類顯示BV患者的陰道菌群beta多樣性較健康育齡期女性的明顯增加;
　　 3.在菌屬的水平上，健康育齡期

17、女性相對豐度最高的是乳酸桿菌，約占95％甚至更高，在乳酸桿菌種的水平上，大部分人以惰性乳酸桿菌或卷曲乳酸桿菌為主，或兩者比例相當;
　　 4.BV患者乳酸桿菌明顯減少甚至消失，且以惰性乳酸桿菌為主。
　　 結論：
　　 1.陰道穹窿與陰道下1/3段的分泌物的微生物群落趨近于相同，即在陰道內不同位置取材對菌群分析影響不大;
　　 2.VVC患者陰道菌群存在四種表型，具有多樣性的特點;
　　 3.健康