人纖溶酶原K5突變體在原核系統(tǒng)的優(yōu)化表達(dá)、活性檢測(cè)與結(jié)構(gòu)改建.pdf

1、中山大學(xué)碩士學(xué)位論文人纖溶酶原K5突變體在原核系統(tǒng)的優(yōu)化表達(dá)、活性檢測(cè)與結(jié)構(gòu)改建Theoptimalexpression，activitydetectionandstructurerebuildingofKringle5ofhumanplasminogenmutantintheprokaryoticexpressionsystem專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)碩士研究生：溫南導(dǎo)師：高國(guó)全教授本課題獲國(guó)家自然科學(xué)基金教育部新世紀(jì)人才基金廣東省

2、科技計(jì)劃項(xiàng)目重大專項(xiàng)廣東省自然科學(xué)基金團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目廣州市科技攻關(guān)重點(diǎn)項(xiàng)目2007年5月廣州資助奎移絕k忍尊孑線，手铘，粉中文摘要究已對(duì)K5基因進(jìn)行了改造，獲得比K5分子量更小、性質(zhì)更穩(wěn)定的K5突變體I(K5mutantl，K5mutl)基因工程純化蛋白。觀察其抑制肝癌血管生成和腫瘤生長(zhǎng)的作用及其效果，從而進(jìn)一步證明K5mutl具有更強(qiáng)的抑制肝癌血管生成和腫瘤生長(zhǎng)的作用，為治療新生血管豐富的肝癌等惡性腫瘤提供新的并擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的基因工程藥

3、物。為了優(yōu)化K5mutl在原核系統(tǒng)的表達(dá)，迸一步降低投入，增大產(chǎn)出，提高K5routl在原核系統(tǒng)pET22bBL21的單位表達(dá)量，本研究第一部分?jǐn)M對(duì)原核系統(tǒng)中各種可能影響表達(dá)的因素如：抗生素濃度、PH、0D600值、IPTG終濃度、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間與細(xì)胞定位等進(jìn)行研究，獲得優(yōu)化的表達(dá)條件，為工業(yè)化大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)生物蛋白藥物奠定基礎(chǔ)，并對(duì)獲得的基因重組蛋白就其生物活性，進(jìn)行細(xì)胞學(xué)上的檢測(cè)。既往獲得的融合蛋白K5mutl，在N端的融合部分

4、含有人工構(gòu)建的蛋白質(zhì)標(biāo)簽Histag等部分，可能在后續(xù)體內(nèi)應(yīng)用中導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生免疫抗體，為了避免該情況的發(fā)生，本研究第二部分?jǐn)M在原有重組體K5mutl的基礎(chǔ)上，對(duì)其進(jìn)行改建，獲得新重組體K5mutlrEK，以使其重組蛋白表達(dá)后能在重組腸激酶的特異性切割作用下，去除原重組蛋白在N端的融合部分，獲得具有天然氨基酸序列的重組蛋白。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：第一部分K5突變體I的優(yōu)化表達(dá)和活性檢測(cè)1優(yōu)化K5mutl的各項(xiàng)表達(dá)條件。在原有實(shí)驗(yàn)方案上，

5、通過(guò)分別調(diào)整下列可能影響表達(dá)的參數(shù)：抗生素濃度、PH、OD600值、IPTG終濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度，同時(shí)固定其它參數(shù)。通過(guò)電泳分析，獲得K5mutl在原核系統(tǒng)pET22bBL21的最優(yōu)表達(dá)條件為：羧芐青霉素濃度為50lag／ml，PH為70的LB培養(yǎng)液中，37“C，搖床230rpm／min，搖菌至OD600值為0910，加入IPTG至終濃度為10retool／L，37℃誘導(dǎo)表達(dá)10h。2獲得高純度可溶性的突變體蛋白。采用優(yōu)化條件誘導(dǎo)