粒細(xì)胞—巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素(IL)-1β在慢性腸炎惡性轉(zhuǎn)化中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景:炎性腸病(Inflammatory Bowel Diseases，IBD)，是一種常見(jiàn)的病因不明的慢性腸道炎癥性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative Colitis，UC）和克羅恩病(Crohn's Diseases，CD)。UC多累及乙狀結(jié)腸和直腸，病理變化局限于結(jié)腸黏膜及黏膜下層，表現(xiàn)為黏膜的破壞和潰瘍的形成，臨床癥狀多為腹瀉、腹痛和黏液膿血便，其具有病程長(zhǎng)、難治愈、易復(fù)發(fā)、癥狀難以控制等特點(diǎn)。近年研究發(fā)現(xiàn)，隨著疾病的

2、遷延不愈和炎癥的加重，并發(fā)結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)逐步增加:UC患者10年后累計(jì)癌變率為2％，20年上升至為8％，而30年以上者則高達(dá)18％。在另一項(xiàng)對(duì)UC人群和正常人群進(jìn)行對(duì)照回顧性研究發(fā)現(xiàn)，UC人群的結(jié)直腸癌的發(fā)病率是正常人群的2-3倍。盡管UC相關(guān)結(jié)直腸癌(Colitis-associated colorectal cancer, CAC)只占整個(gè)人群中結(jié)直腸癌的1％-2％，但它被認(rèn)為是UC的嚴(yán)重并發(fā)癥，據(jù)統(tǒng)計(jì)，約15％的UC患者死于癌癥。

3、
　　目前，人們對(duì)于慢性不可控性腸炎如何促進(jìn)腸道腫瘤的發(fā)生知之甚少。鑒于腸道是人體比較特殊的器官，定居著數(shù)以億計(jì)的共生菌，這些共生菌對(duì)腸道腫瘤產(chǎn)生的影響逐漸被人們所重視。有研究表明，腸道上皮細(xì)胞屏障的破壞可以導(dǎo)致腸道共生菌的移位，透過(guò)腸道粘膜屏障，進(jìn)而引起持續(xù)的炎癥反應(yīng)。慢性炎性反應(yīng)造成大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，繼而釋放炎性細(xì)胞因子以及活性介質(zhì)。腫瘤微環(huán)境中浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞以及他們所營(yíng)造的炎性微環(huán)境，可以引起腸上皮細(xì)胞的突變，并且為突變細(xì)

4、胞增殖、存活、逃避免疫監(jiān)視進(jìn)而順利完成原位腫瘤的生成提供便利。
　　目的:探究促炎細(xì)胞因子GM-CSF和IL-1β在腸炎向腸癌惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中的作用及其機(jī)制。
　　方法及結(jié)果:我們利用氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM）和葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium, DSS）的聯(lián)合誘導(dǎo)作用建立了腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌的動(dòng)物模型，這個(gè)模型可以很好的模擬UC病人的腸炎惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程，因此在1990年獲得國(guó)際公認(rèn)

5、，成為廣泛使用的研究CAC的動(dòng)物模型。利用該模型我們深入研究了腸炎惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中的免疫學(xué)機(jī)制，具體結(jié)果包括:
　　1)在腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌誘導(dǎo)過(guò)程中，根據(jù)疾病的發(fā)展階段設(shè)置了不同的檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，以便對(duì)腫瘤產(chǎn)生過(guò)程持續(xù)監(jiān)控。我們發(fā)現(xiàn)在炎癥期，以多種炎性細(xì)胞因子大量持續(xù)性釋放（如GM-CSF、IL-1β、IL-6、VEGF）為標(biāo)志。流式和免疫組化結(jié)果顯示，腸道組織中開(kāi)始浸潤(rùn)大量的中性粒細(xì)胞。在腫瘤發(fā)生期，以腸道出現(xiàn)明顯可見(jiàn)的腫瘤為標(biāo)志，此

6、時(shí)浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞數(shù)量顯著增加。因此研究浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞在腸炎惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中的作用，成為我們的研究重點(diǎn)之一。
　　2)用抗體對(duì)建模小鼠體內(nèi)中性粒細(xì)胞進(jìn)行清除，可以有效減少腫瘤產(chǎn)生;浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞輸入移植瘤模型小鼠體內(nèi)可以促進(jìn)移植瘤的生長(zhǎng)，這些結(jié)果都表明腸粘膜中浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞在腸炎惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)揮重要的促進(jìn)作用。
　　3)細(xì)胞因子表達(dá)譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞產(chǎn)生大量的IL-1β，并且這種分泌效果具有部位特異性:相比于

7、腫瘤部位浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞，CAC小鼠脾臟中的中性粒細(xì)胞IL-1β的分泌量很低，說(shuō)明中性粒細(xì)胞表達(dá)IL-1β受微環(huán)境的調(diào)控。對(duì)IL-1β與CAC的關(guān)系研究顯示，用IL-1受體拮抗劑阻斷IL-1信號(hào)能夠明顯減少腫瘤的產(chǎn)生，這表明IL-1β是CAC發(fā)生的重要推動(dòng)因素。
　　4)關(guān)于IL-1β如何促進(jìn)CAC的產(chǎn)生，我們發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是體內(nèi)還是體外實(shí)驗(yàn)均顯示，IL-1β是誘導(dǎo)腸粘膜定居的單核吞噬細(xì)胞分泌過(guò)量IL-6的重要因子，這導(dǎo)致IL-6持續(xù)

8、性的刺激腸上皮細(xì)胞中STAT3/NF-KB信號(hào)通路的活化，致使上皮細(xì)胞的失控性增殖，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。用抗體中和IL-6能夠有效的抑制CAC的產(chǎn)生。這就解釋了IL-1β促進(jìn)CAC產(chǎn)生的作用機(jī)理。
　　通過(guò)以上的實(shí)驗(yàn)，我們揭示了一條新的慢性炎癥促進(jìn)腫瘤產(chǎn)生的作用軸，其以浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞分泌大量的IL-1β為核心事件，以細(xì)胞因子、免疫細(xì)胞共同參與為典型特征。
　　另外我們也發(fā)現(xiàn)了一條免疫細(xì)胞非依賴的途徑，這條通路以腸上皮細(xì)胞釋

9、放大量的GM-CSF為核心事件，具體結(jié)果如下:
　　1)我們發(fā)現(xiàn)在炎癥期和腫瘤產(chǎn)生期GM-CSF和VEGF在腸道中都持續(xù)高表達(dá)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，二者主要是由腸上皮細(xì)胞分泌的。
　　2)在小鼠結(jié)腸癌上皮細(xì)胞系CT-26和人結(jié)腸癌上皮細(xì)胞系HCT116上，GM-CSF均能誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)。
　　3)對(duì)涉及的信號(hào)通路研究，我們發(fā)現(xiàn)GM-CSF通過(guò)ERK1/2信號(hào)通路促進(jìn)VEGF的表達(dá)，在體外用U0126對(duì)ERK1/2信號(hào)通

10、路進(jìn)行阻斷，可以逆轉(zhuǎn)GM-CSF對(duì)VEGF的表達(dá)的促進(jìn)作用。
　　4)在體內(nèi)，用GM-CSF抗體對(duì)建模小鼠進(jìn)行治療，可以明顯減少腫瘤的產(chǎn)生，抑制腸上皮細(xì)胞的ERK1/2信號(hào)通路，進(jìn)而降低VEGF的表達(dá)，減少其VEGF受體的磷酸化水平，減少血管生成。此外，我們用VEGF抗體對(duì)建模小鼠進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)可以明顯減少血管生成，降低腫瘤生長(zhǎng)必要的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，進(jìn)而抑制腫瘤產(chǎn)生。
　　5) transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GMCSF能夠通過(guò)誘

11、導(dǎo)VEGF的釋放進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力。
　　兩條通路促進(jìn)腸炎的惡性轉(zhuǎn)化都存在更上游的問(wèn)題，那就是什么原因觸發(fā)了中性粒細(xì)胞的聚集并釋放大量IL-1β以及誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞表達(dá)過(guò)量的GM-CSF?我們發(fā)現(xiàn)腸道內(nèi)共生菌來(lái)源的LPS起到了關(guān)鍵作用，表明有害共生菌的移位在促腸炎/癌的惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中起到了關(guān)鍵的作用。
　　結(jié)論:腸道內(nèi)有害的共生菌來(lái)源的LPS，可以刺激中性粒細(xì)胞分泌大量的IL-1β并促進(jìn)上皮細(xì)胞分泌過(guò)量的GM-C