紅豆杉紫杉烷13α-羥基化酶基因的克隆及表達調(diào)控的研究.pdf

1、紫杉醇(Taxol)是從紫杉樹皮中分離提取到的天然抗腫瘤物質(zhì)，是迄今為止最具抗癌活性的天然化合物之一，紫杉酚能夠抑制細胞在G2-M期增殖,阻斷有絲分裂，從而有效抑制癌細胞增生。然而紫杉醇在植物體內(nèi)含量相當?shù)停又渖L緩慢，這對紫杉醇的進一步開發(fā)利用造成了很大的困難。紫杉烷13α–羥基化酶(Taxane13α-hydroxylase）屬于依賴細胞色素P450的單加氧酶，為紫杉醇合成途徑的關(guān)鍵羥化酶，是紫杉醇及其半合成前體生物合成調(diào)控的十

2、分重要的靶標。本研究克隆得到我國東北紅豆杉（Taxus cuspidata）紫杉烷13α-羥基化酶基因，構(gòu)建了其植物表達載體并轉(zhuǎn)化煙草。在此基礎(chǔ)上克隆了幾個可能與紫杉烷13α-羥基化酶基因相作用的microRNA(miRNA)基因，構(gòu)建其植物表達載體并進行了其中miRNA基因與紫杉烷13α-羥基化酶基因共轉(zhuǎn)化試驗。主要研究內(nèi)容和研究結(jié)果如下：
　　（1）本研究克隆得到東北紅豆杉13OH的基因全長，將它與報道的13OH基因進行同源性

3、比較后發(fā)現(xiàn)9個堿基有差異，同源性為99.38％。
　　（2）根據(jù)不同的報告基因要求，成功構(gòu)建了13OH基因在 Pcambia1305.1和pcambia1304及pEGAD上的三種植物表達載體，分別含有GUS基因、GUS和mGFP5、EGFP作為報告基因。
　?。?）將構(gòu)建在Pcambia1305.1的13OH基因成功轉(zhuǎn)化到煙草中，獲得可在煙草中表達13α-羥基化酶基因的轉(zhuǎn)基因煙草植株。
　?。?）從水稻及擬南芥中克隆

4、出miR160e、miR164e、miR165a、miR166m、miR169d小調(diào)節(jié)子前體，測序結(jié)果表明除164e有一個堿基差異166m有兩個堿基差異外，其余同源性為100%。
　　（5）分別構(gòu)建了miR160e、miR164e、miR165a、miR166m、miR169d在Pcambia1305.1上和miR165a、miR169d在pEGAD上的七種植物表達載體，便于不同的篩選。
　?。?）瞬時轉(zhuǎn)化GUS染色結(jié)果顯示