RNA干擾抑制Skp2表達(dá)對人喉癌細(xì)胞系Hep-2影響的實驗研究.pdf

1、背景與目的：
　　 喉癌是危害人體健康和生命的惡性腫瘤,約占耳鼻咽喉惡性腫瘤的10～35％,其中以喉鱗狀細(xì)胞癌(LSCC)最為多見,可達(dá)90％。喉癌在我國東北地區(qū)是高發(fā)區(qū),而且逐年增長。目前,喉切除術(shù)是治療喉癌的主要手段,但術(shù)后對患者的生活質(zhì)量會產(chǎn)生較大影響,且對于晚期及全身狀態(tài)不佳的患者無法有效實施,雖可輔以放療及化療,效果仍不理想。因此,深入探討喉癌的發(fā)生機(jī)制,尋找利用基因干預(yù)的手段進(jìn)行治療是目前喉癌研究的熱點。
　　

2、 Skp2基因是最近發(fā)現(xiàn)的癌基因,與腫瘤的增殖、分化有關(guān)。在對喉癌的研究中發(fā)現(xiàn),Skp2表達(dá)與臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān),提示該基因表達(dá)上調(diào)可能與LSCC的侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān);同時,其表達(dá)與抑癌基因p27表達(dá)強(qiáng)度呈明顯負(fù)相關(guān),表明在LSCC的進(jìn)展過程中,Skp2表達(dá)的上調(diào)可能通過泛素-蛋白酶體途徑導(dǎo)致p27表達(dá)減少,使其不能有效發(fā)揮細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子的抑癌作用,促使癌細(xì)胞獲得更高的侵襲轉(zhuǎn)移能力。因此,我們推測Skp2可能是喉部惡性腫

3、瘤基因治療的靶點。
　　 RNA干擾(RNA interference,RNAi)是新近發(fā)展起來的一種封閉基因表達(dá)的有效方法,它比反義寡核苷酸技術(shù)能更高效地抑制目的基因的表達(dá)。已有研究證實化學(xué)合成siRNA(small interfering RNA)能高效地介導(dǎo)RNAi作用,但作用持時間短,而采用siRNA表達(dá)載體尤其是慢病毒載體的方法能有效延長作用時間。
　　 本研究試圖通過細(xì)胞體外及動物體內(nèi)試驗,利用慢病毒介導(dǎo)的R

4、NA干擾技術(shù)抑制癌基因Skp2的表達(dá),觀察其對人喉癌細(xì)胞系Hep-2細(xì)胞的增殖、調(diào)亡以及對抑癌基因p27表達(dá)的影響,為今后應(yīng)用該技術(shù)研究和治療喉癌提供實驗依據(jù)。
　　 方法：
　　 1、針對人Skp2基因的RNAi載體構(gòu)建利用計算機(jī)輔助設(shè)計軟件,設(shè)計合成四條針對Skp2基因cds區(qū)的siRNA序列,同時設(shè)計一條對于任何基因無干擾效果序列Negative用于對照組實驗,并將其定向克隆入真核表達(dá)載體pSIH1-H1-copG

5、FP shRNA Vector,獲得五個重組質(zhì)粒:pSIH1-negative、pSIH1-siRNA1、pSIH1-siRNA2、pSIH1-siRNA3、pSIH-siRNA4。
　　 2、抑制Skp2表達(dá)對人喉癌細(xì)胞系Hep-2影響的體外實驗(1)在Hep-2細(xì)胞中針對Skp2基因篩選有效的干擾序列:利用脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hep-2細(xì)胞,熒光實時定量PCR實驗檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中的Skp2 mRNA的變化,根據(jù)結(jié)果選擇一個

6、含有最強(qiáng)抑制效果的干擾序列的質(zhì)粒用于后續(xù)試驗;
　　 (2)用慢病毒系統(tǒng)建立干擾Skp2基因的穩(wěn)定細(xì)胞株:以三載體包裝的含有篩選出的pSIH-siRNA3和pSIH-negative質(zhì)粒的慢病毒原液感染Hep-2細(xì)胞,觀察轉(zhuǎn)染效果,獲得Hep2-siRNA,Hep2-neg兩組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株;
　　 (3)熒光實時定量PCR檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中Skp2和p27 tuRNA的表達(dá);
　　 (4)Western bl

7、ot法檢測Hep2,Hep2-siRNA,Hep2-neg三組細(xì)胞中的Skp2和p27蛋白表達(dá)量的變化;
　　 (5)MTT法檢測Hep2,Hep2-siRNA,Hep2-neg三組細(xì)胞的增殖情況;
　　 (6)流式細(xì)胞儀檢測三組細(xì)胞凋亡情況。
　　 3、抑制Skp2表達(dá)對人喉癌細(xì)胞系Hep-2影響的體內(nèi)實驗(1)裸鼠隨機(jī)分成三組,將三組細(xì)胞按照1.0×107個/ml的濃度,每只鼠0.2ml背部皮下接種;

8、　　 (2)觀察裸鼠的成瘤情況,30天后處死裸鼠,經(jīng)皮下剝離腫瘤組織,比較各組瘤體大小和瘤重;
　　 (3)將瘤組織切片進(jìn)行常規(guī)病理檢查,并采用免疫組化方法對三組裸鼠瘤組織中Skp2和p27蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測。
　　 結(jié)果：
　　 1、利用PCR分析,DNA測序證實靶向Skp2特異性siRNA表達(dá)載體pSIH1-negative、pSIH1-siRNA1、pSIH1-siRNA2、pSIH1-siRNA3、pS

9、IH1-siRNA4重組質(zhì)粒已成功構(gòu)建。
　　 2、五組重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hep-2細(xì)胞后對Skp2 mRNA抑制率分別為12％,42％,14％,46％和29％,但細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率不高,僅為50％左右;重組質(zhì)粒pSIH1-siRNA3對Hep-2細(xì)胞Skp2基因的抑制作用最強(qiáng)。
　　 3、應(yīng)用慢病毒包裝系統(tǒng)包裝pSIH1-negative和pSIH1-siRNA3質(zhì)粒后以病毒原液感染Hep-2細(xì)胞,轉(zhuǎn)染效率可提高至90％左右,且轉(zhuǎn)

10、染細(xì)胞株可穩(wěn)定傳代培養(yǎng)。
　　 4、應(yīng)用熒光實時定量PCR檢測Hep2,Hep2-siRNA,Hep2-neg三組細(xì)胞中的Skp2和p27 mRNA表達(dá)量的變化,顯示Hep2-siRNA細(xì)胞中Skp2 mRNA表達(dá)量與Hep2組細(xì)胞中的表達(dá)量相比下調(diào)了74％,而p27 mRNA表達(dá)量則上調(diào)了38％,Hep2-neg組無明顯變化。
　　 5、Western blot法檢測Hep2,Hep2-siRNA,Hep2-neg三組

11、細(xì)胞中的Skp2和p27蛋白表達(dá)量的變化,顯示Hep2-siRNA細(xì)胞中Skp2蛋白表達(dá)量與Hep2組細(xì)胞中的表達(dá)量相比下調(diào)了約76％,p27蛋白表達(dá)量則上調(diào)了約89％,Hep2-neg組無明顯變化。
　　 6、MTT法檢測細(xì)胞生長增殖情況結(jié)果顯示Hep2-siRNA組細(xì)胞增殖明顯減慢,而Hep2-neg組細(xì)胞與Hep2組相比,細(xì)胞增殖無明顯變化。
　　 7、流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示Hep2,Hep2-neg和Hep2-s

12、iRNA三組細(xì)胞凋亡率分別為(2.86±0.21)％,(3.58±0.16)％和(16.64±0.17)％,Hep2-siRNA組與其他兩組比較細(xì)胞凋亡率明顯增加,Hep2-neg組和Hep2組之間無顯著差異。
　　 8、裸鼠成瘤實驗顯示與兩對照組相比,轉(zhuǎn)染陽性質(zhì)粒組細(xì)胞裸鼠致瘤活性明顯降低,生長減慢,瘤體體積明顯較小;而轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒組細(xì)胞裸鼠致瘤性及生長活性與正常培養(yǎng)組相比無明顯差異。接種后30天轉(zhuǎn)染陽性質(zhì)粒組瘤體重量較對照組

13、明顯減輕,抑瘤率為79.55％;而轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒組細(xì)胞裸鼠致瘤體重量與正常培養(yǎng)組比較無明顯差異。
　　 9、荷瘤裸鼠瘤體HE染色切片結(jié)果顯示正常培養(yǎng)組及轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒組腫瘤組織中央可見壞死灶,癌細(xì)胞增生活躍,癌巢形成明顯,瘤組織以實質(zhì)為主,間質(zhì)少見;轉(zhuǎn)染陽性質(zhì)粒組瘤體中央壞死減少,腫瘤組織間質(zhì)較多見。正常培養(yǎng)組及轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒組比較,瘤體病理學(xué)特征無明顯差異。
　　 10、荷瘤裸鼠瘤體免疫組化結(jié)果顯示正常培養(yǎng)組及轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒組

14、腫瘤組織中Skp2蛋白高表達(dá),p27蛋白表達(dá)顯著下調(diào);轉(zhuǎn)染陽性質(zhì)粒組裸鼠瘤體中Skp2蛋白表達(dá)明顯減弱,p27蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。
　　 結(jié)論：
　　 1、針對Skp2基因設(shè)計的慢病毒介導(dǎo)的siRNA表達(dá)載體能從mRNA和蛋白水平特異、高效地抑制人喉癌細(xì)胞系Hep-2中癌基因Skp2的表達(dá),并上調(diào)抑癌基因p27的表達(dá);同時,抑制腫瘤細(xì)胞的惡性增殖,增加其凋亡率。
　　 2、在喉癌的發(fā)生發(fā)展中,Skp2與p27的表達(dá)