VAD1 mRNA在新型隱球菌性腦膜炎診斷中的意義及其與細胞因子分泌格局的關(guān)系.pdf

1、目的：利用實時熒光定量PCR(RT-FQ-PCR)方法檢測VAD1 mRNA在新型隱球菌性腦膜炎(CNM)患者腦脊液中的表達，探討VAD1 mRNA表達量與新型隱球菌(CN)數(shù)量、臨床療效和預(yù)后的關(guān)系，為將其應(yīng)用于CN感染的診斷和療效判斷奠定基礎(chǔ)。利用ELISA方法定量測定CNM患者的Th1/Th2細胞因子，結(jié)合其VAD1 mRNA表達量及臨床表現(xiàn)，闡明三者之間的關(guān)系，擬從細胞因子水平探討VAD1 mRNA的表達在CNM發(fā)生、發(fā)展中的作

2、用以及為CNM的免疫治療提供新的依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.RT-FQ-PCR檢測方法的建立：根據(jù)GenBank收錄的新型隱球菌VAD1mRNA全序列(AY-661864)，設(shè)計特異性引物和TaqMan探針，以重組質(zhì)粒pGEMT-Easy-VAD1為標準品，建立RT-FQ-PCR的定量標準曲線，并評價方法的靈敏度、特異度及重復(fù)性。
　　 2.RT-FQ-PCR法診斷效能的臨床評價：利用RT-FQ-PCR法、墨

3、汁染色法、真菌培養(yǎng)法及CN抗原測定法檢測25例CNM組和30例對照組患者腦脊液，比較各法的診斷敏感度及特異度。
　　 3.RT-FQ-PCR法的初步臨床應(yīng)用：檢測25例CNM患者抗真菌治療前與治療后腦脊液中VAD1 mRNA的表達量，分析VAD1 mRNA與CN數(shù)量、臨床療效和預(yù)后的關(guān)系。比較不同藥物治療組VAD1 mRNA的表達量的變化程度，從而評價它們CNM療效上的差異。
　　 4.VAD1 mRNA與Th1/Th2

4、細胞因子相關(guān)性研究：利用ELISA方法定量測定CNM患者的Th1/Th2細胞因子，結(jié)合其VAD1 mRNA表達量及臨床表現(xiàn)，闡明三者之間的關(guān)系，確定VAD1在CNM致病和診斷中的作用，為揭示CN感染時，菌體致病與宿主防御之間所引發(fā)細胞因子分泌格局的變化，以及CN感染轉(zhuǎn)歸多樣性的細胞免疫學和分子生物學基礎(chǔ)。
　　 結(jié)果：
　　 1.RT-FQ-PCR檢測方法的建立：
　　 成功建立了新型隱球菌VAD1 mRNA的R

5、T-FQ-PCR檢測方法。建立的標準曲線相關(guān)系數(shù)為-0.9979；檢測線性范圍為103～107拷貝數(shù)/μl；檢測靈敏度為101拷貝數(shù)/μl；高、中、低濃度質(zhì)粒標準品批內(nèi)CV值分別為0.65％、0.89％和1.23％；RT-FQ-PCR法檢測CN的敏感度為96％，特異度為100％。
　　 2.實時熒光定量PCR法診斷效能的臨床評價：
　　 利用所建立的RT-FQ-PCR檢測方法檢測25例隱腦組和30例對照組患者的VAD1

6、mRNA，結(jié)果表明實時熒光定量PCR法的敏感度為96％、特異度為100％；墨汁染色法的敏感度為72％、特異度為100％；培養(yǎng)法的敏感度為64％、特異度為100％；抗原測定法的敏感度為96％、特異度為96.7％。明顯高于墨汁染色法(x2=4.167，P＜0.05)及真菌培養(yǎng)法(x2=6.125，P＜0.05)，與CN抗原測定法差異無統(tǒng)計學意義(x2=0，P＞0.05)。
　　 3.實時熒光定量PCR法初步臨床應(yīng)用：
　　

7、3.1 25例CNM患者急性期VAD1 mRNA表達量為3.042±0.906，鞏固期為2.187±0.665，定量值經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進行t檢驗，結(jié)果t=4.583，P＜0.01，提示急性期與鞏固期VAD1 mRNA表達存在顯著性差異，急性期明顯高于鞏固期。
　　 3.2 VAD1 mRNA與隱球菌數(shù)量、顱內(nèi)壓及腦脊液葡萄糖濃度具有顯著相關(guān)性(P值分別為＜0.01，＜0.01，＜0.05)。其中VAD1 mRNA與隱球菌數(shù)量、顱內(nèi)壓

8、呈正相關(guān)，與腦脊液葡萄糖濃度呈負相關(guān)。
　　 3.3 兩性霉素B(AmB)聯(lián)用5-氟胞嘧啶(5-FC)組、5-氟胞嘧啶(5-FC)聯(lián)用大扶康(FCZ)組、兩性霉素B(AmB)與5-氟胞嘧啶(5-FC)及大扶康(FCZ)三聯(lián)合用組三組藥物治療前后VAD1 mRNA表達量差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，其中AmB+5-FC+FCZ組P＜0.01；三組間兩兩比較時發(fā)現(xiàn)，三組藥物治療前后VAD1 mRNA表達量下降程度無明顯差異(P

9、＞0.05)。
　　 4.VAD1 mRNA與細胞因子分泌格局的關(guān)系
　　 CNM組患者鞏固期腦脊液IFN-γ、IL-12、 IL-10水平與急性期相比均有顯著差異，其中鞏固期IFN-γ水平顯著高于急性期，IL-12和IL-10水平顯著低于急性期；CNM組患者急性期腦脊液IFN-γ/IL-10、IL-12/IL-10水平均低于正常對照組，鞏固期IFN-γ/ IL-10、IL-12/IL-10水平顯著高于急性期。VAD1

10、mRNA表達量與IFN-γ呈顯著負相關(guān)；與IL-10呈顯著正相關(guān)；與IL-12不相關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 1.在國內(nèi)外首次建立了新型隱球菌VAD1 mRNA的實時熒光定量PCR檢測方法，有較高的敏感度、特異性及較好的重復(fù)性。為進一步探索新型隱球菌VAD1基因的功能及其與隱球菌病的發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性提供了方法學基礎(chǔ)。
　　 2.VAD1 mRNA表達水平與疾病嚴重程度相關(guān)，其可能在新型隱球菌性腦膜炎的發(fā)生、發(fā)展中

11、起作用，并有可能成為新型隱球菌感染的基因診斷、治療的新靶點。
　　 3.VAD1 mRNA表達水平與新型隱球菌性腦膜炎的治療效果有關(guān)，可能為新型隱球菌的毒力和致病性判斷以及隱球菌性腦膜炎診斷、療效判斷和預(yù)后判斷提供新的依據(jù)。
　　 4.新型隱球菌感染以Th2應(yīng)答占優(yōu)勢，鞏固期免疫應(yīng)答狀態(tài)向Th1漂移，這可能是新型隱球菌發(fā)生免疫逃逸，從而導致新型隱球菌性腦膜炎發(fā)生的原因之一。VAD1作為重要的毒力決定因子，其發(fā)揮作用可能與