PPAR-γ激動劑對皮膚成纖維細胞增殖影響及相關(guān)機制.pdf

1、目的：
　　探討過氧化物酶體增殖物激活受體γ(Peroxisome proliferator activatedReceptor-gammaγ)激動劑羅格列酮(rosiglitazone，Ros)對皮膚成纖維細胞增殖的影響及相關(guān)機制。
　　方法：
　　1.皮膚成纖維細胞的獲取及培養(yǎng)
　　將某院行包皮環(huán)切術(shù)患者手術(shù)中切取下來的皮膚組織，采用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)皮膚成纖維細胞原代，并傳代，3-7代細胞用于實驗。
　

2、　2.CCK-8法測定Ros對細胞增殖的影響
　　采用CCK-8法檢測10、50μmol/L Ros的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞24、48、72h后細胞增殖抑制率，判斷其對增殖的影響。增殖抑制率=[（對照組一實驗組）/（對照組-空白組）]×100％。
　　3.LDH釋放實驗檢測細胞LDH釋放情況
　　采用LDH釋放實驗檢測10、50μmol/L Ros的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞24、48、72h后LDH釋放率，判斷其對細胞損傷的影響。LDH

3、釋放率(％)=[培養(yǎng)液LDH活性/（培養(yǎng)液LDH活性+細胞LDH活性）]×100％。
　　4.Western blotting印跡方法及Hoechst33258染色觀察細胞凋亡情況
　　采用Western blotting印跡方法及Hoechst33258染色觀察10、50μ mol/L Ros的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞24、48、72h后細胞凋亡情況及細胞內(nèi)活化的caspase-3蛋白表達情況。
　　結(jié)果：
　　1.經(jīng)組

4、織塊培養(yǎng)1周左右可見白組織塊邊緣游出梭型細胞，胞漿清晰，胞核為類圓形，此即為皮膚成纖維細胞，該細胞經(jīng)傳代3至7代，細胞形態(tài)未發(fā)生改變，生長狀況仍良好，符合實驗要求。
　　2.CCK-8法檢測發(fā)現(xiàn)低濃度10μmol/L Ros對成纖維細胞增殖無明顯影響且其不受時間影響，高濃度50μmol/L Ros對成纖維細胞增殖的抑制顯著，抑制程度呈時間依賴性。10μmol/L Ros作用24、48、72h后，其細胞增殖抑制率分別為(3.2±0.

5、17)％(5.9±0.23)％(6.6±0.31)％，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);50μmol/L Ros作用24、48、72h后，其細胞增殖抑制率分別為(24.7±1.35)％(38.2±2.13)％(47.6±2.87)％，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01).
　　3.LDH釋放實驗檢測發(fā)現(xiàn)與對照組LDH釋放率(7.72±0.81)％相比，低濃度組(10μ mol/L)細胞LDH的釋放量分別為(8.47±0.73)％、(9

6、.02±0.97)％、(9.84±0.77)％，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);而高濃度組(50μ mol/L)細胞LDH釋放量隨時間逐漸增多，分別為(22.53±1.73)％、(34.12±2.07)％、(50.48±4.07)％，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　4.Hoechst染色觀察低濃度組(10μmol/L)細胞的Hoechst染色淡而均勻，而經(jīng)高濃度(50μmol/L)處理的細胞，細胞核呈濃染，表現(xiàn)為染色質(zhì)

7、固縮特征的凋亡細胞，凋亡小體增多，并且發(fā)現(xiàn)隨著高濃度Ros作用時間的增加，細胞凋亡特征越明顯。Western blotting印跡方法發(fā)現(xiàn)高濃度(50μmol/L)處理的細胞胞內(nèi)活化的caspase-3蛋白表達隨時間逐漸增高，其活化的caspase-3/GAPDH蛋白表達量分別為:2.25±0.19、2.73±0.21、3.58±0.27，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)
　　結(jié)論：
　　1.低濃度10μmol/L Ros對

8、皮膚成纖維細胞增殖無明顯影響，高濃度50μ mol/L Ros可抑制皮膚成纖維細胞增殖，并且呈現(xiàn)時間依賴性。
　　2.高濃度50μmol/L Ros可促進皮膚成纖維細胞損傷，并且隨著時間的增加損傷作用加強，而低濃度10μmol/L Ros無明顯細胞損傷現(xiàn)象。
　　3.高濃度50μmol/L Ros可促進皮膚成纖維細胞凋亡發(fā)生，呈現(xiàn)時間依賴性，胞內(nèi)活化的caspase-3蛋白隨作用時間增加表達量逐漸增加，而低濃度10μ mol