辣椒素受體在大鼠神經(jīng)痛疼痛發(fā)生機(jī)制中的作用.pdf

1、目的：辣椒素受體(vanilloid receptor type1,VR1)于1997年被克隆,是一種非選擇性陽(yáng)離子通道蛋白質(zhì),主要分布于傷害性感覺(jué)神經(jīng)元。它可被化學(xué),機(jī)械和熱刺激如溫度(>43℃)、酸(pH<6,0)等激活,使陽(yáng)離子(主要是Ca2+)從胞外進(jìn)入胞內(nèi),從而產(chǎn)生痛覺(jué)。雖然已有少量文獻(xiàn)報(bào)道在各種神經(jīng)痛疼痛模型中,辣椒素受體的表達(dá)都會(huì)發(fā)生變化,但是對(duì)于辣椒素受體在神經(jīng)痛疼痛發(fā)生機(jī)制中的作用仍然不是很清楚。本實(shí)驗(yàn)擬應(yīng)用RNA干擾

2、技術(shù),以脊神經(jīng)結(jié)扎(SNL)神經(jīng)痛模型大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,揭示辣椒素受體在神經(jīng)痛疼痛發(fā)生機(jī)制中的作用。
　　 方法：本實(shí)驗(yàn)首先構(gòu)建靶向大鼠辣椒素受體的siRNA慢病毒載體(pRNAT-U6.2/Lenti-siVR1),并用蛛網(wǎng)膜下腔注射的方式將其注射到正常大鼠體內(nèi),鑒定其是否可以在整體水平沉默VR1的表達(dá)。另一方面,制作脊神經(jīng)結(jié)扎(SNL)神經(jīng)痛大鼠模型,觀察疼痛行為的經(jīng)時(shí)變化過(guò)程,找出疼痛最敏感最穩(wěn)定的時(shí)期進(jìn)行后續(xù)研究。此后制作

3、SNL大鼠模型并分三組,分別是陽(yáng)性組(注射pRNAT-U6.2/Lenti-siVR1)、陰性組(注射無(wú)關(guān)序列)及模型組(不做任何處理)。在SNL手術(shù)后第5天將所合成的DRNAT-U6.2/Lenti-siVR1注射到大鼠蛛網(wǎng)膜下腔,特異性地使SNL大鼠辣椒素受體的mRNA降解,從而使該基因的表達(dá)沉寂。從行為學(xué)上觀察神經(jīng)痛大鼠的疼痛行為是否會(huì)有所改善,同時(shí)應(yīng)用RT-PCR技術(shù)半定量檢測(cè)辣椒素受體的mRNA是否會(huì)下降,應(yīng)用Western

4、Blot技術(shù)檢測(cè)辣椒素受體蛋白的表達(dá)是否會(huì)下降。
　　 結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建靶向辣椒素受體的siRNA慢病毒載體(pRNAT-U6.2/Lenti-siVR1),經(jīng)動(dòng)物整體實(shí)驗(yàn)證實(shí)其可以沉默VR1mRNA的表達(dá)。蛛網(wǎng)膜下腔注射pRNAT-U6.2/Lenti-siVR16小時(shí)后,陽(yáng)性組和陰性組大鼠的縮足閾(PWT)沒(méi)有顯著差異性,即此時(shí)SD大鼠仍然處于痛覺(jué)過(guò)敏時(shí)期。但12、24小時(shí)后,陽(yáng)性組大鼠的PWT明顯升高,分別為9.7g±

5、2.4g、10.9±2.8g,而陰性組大鼠的PWT分別為3.8g±0.7g、3.9g±0.8g,陽(yáng)性組與陰性組比較有顯著差異(P<0.05)。蛛網(wǎng)膜下腔注射siVR148小時(shí)后,陽(yáng)性組和陰性組大鼠的PWT差異性消失(P>0.05),其PWT分別為5.2±1.3g、4.9±1.8g。在RT-PCR試驗(yàn)中,可以觀察到注射12小時(shí)后,陽(yáng)性組大鼠與陰性組大鼠相比,其脊髓背角和DRG神經(jīng)元內(nèi)辣椒素受體的mRNA均顯著降低,脊髓背角VR1mRNA降

6、低了約48.7％,而DRG mRNA約為51.4％；而陰性組與正常組及模型組相比較,無(wú)論是脊髓背角還是DRG神經(jīng)元其mRNA并沒(méi)有顯著性差異。Western Blot實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了辣椒素受體蛋白的表達(dá)也會(huì)降低,脊髓背角VR1蛋白降低了約44.3％,而DRG mRNA約為62.4％；而陰性組與正常組及模型組相比較,無(wú)論是脊髓背角還是DRG神經(jīng)元其蛋白表達(dá)都沒(méi)有顯著性差異。
　　 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的靶向大鼠辣椒素受體的siRNA慢病