基于蛋白質(zhì)組學(xué)策略的膿毒癥生物標(biāo)志物研究.pdf

1、膿毒癥是指由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemicinflammatory response syndrome，SIRS)，是重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)常見的死亡原因之一。膿毒癥的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜且尚不明確，涉及患者復(fù)雜的原發(fā)病、復(fù)雜的病原體感染、復(fù)雜的毒力因子、復(fù)雜的宿主基因組多態(tài)性和機(jī)體反應(yīng)性、復(fù)雜的多系統(tǒng)相互作用網(wǎng)絡(luò)等。膿毒癥這種復(fù)雜性和非線性的特點(diǎn)為我們?cè)\斷膿毒癥和預(yù)測(cè)其預(yù)后帶來嚴(yán)重困難，也是導(dǎo)致其病死率居高不下的主要原因。

2、近年來，不少學(xué)者致力于膿毒癥生物標(biāo)志物(sepsis biomarker)研究，試圖發(fā)現(xiàn)某些可以提示膿毒癥存在與否及其嚴(yán)重程度、揭示其發(fā)病機(jī)制、區(qū)分各種微生物感染以及全身炎癥反應(yīng)和局部感染的生物標(biāo)志物，以促進(jìn)膿毒癥的診斷、預(yù)測(cè)和新的防治方法的研發(fā)。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)超過200個(gè)生物標(biāo)志物與膿毒癥的診斷或預(yù)后預(yù)測(cè)有關(guān)，但其敏感性和特異性不高，單個(gè)生物標(biāo)志物對(duì)膿毒癥的診斷、預(yù)后預(yù)測(cè)效果并不理想。目前，尚無理想的生物標(biāo)志物用于膿毒癥的臨床診斷或

3、預(yù)后預(yù)測(cè)。因此，采用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)更多新的、可靠的生物標(biāo)志物以提高膿毒癥的診斷、預(yù)后預(yù)測(cè)及防治水平具有重要的科學(xué)意義。
　　本研究擬采用盲腸結(jié)扎穿刺(CLP)的方法來制備大鼠膿毒癥模型，并根據(jù)死亡時(shí)間將實(shí)驗(yàn)大鼠分為四組:假手術(shù)組、CLP24h死亡組、CLP48h死亡組和CLP存活組。各組大鼠于CLP術(shù)后12h通過心臟穿刺取血2-2.5ml，血液凝固后經(jīng)離心獲得血清。血清去高豐度蛋白后用iTRAQTM試劑進(jìn)行標(biāo)記，通過二維液相色

4、譜串聯(lián)質(zhì)譜鑒定假手術(shù)對(duì)照組、膿毒癥存活組、24h死亡組和48h死亡組血清蛋白質(zhì)組的變化。采用ELISA技術(shù)對(duì)各差異表達(dá)蛋白進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，從中篩選出新的生物標(biāo)志物，采用Logistic回歸分析方法建立膿毒癥診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)的數(shù)學(xué)模型。同時(shí)，從發(fā)現(xiàn)的生物標(biāo)志物中挑選正五聚蛋白(PTX3)用于臨床膿毒癥患者的診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)研究，并將其結(jié)果與傳統(tǒng)的生物標(biāo)志物降鈣素原(PCT)、C反應(yīng)蛋白（CRP）進(jìn)行對(duì)比，評(píng)估其在膿毒癥患者診斷和預(yù)后判斷中的潛

5、在意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　運(yùn)用iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法，從膿毒癥大鼠血清中共鑒定出162個(gè)蛋白質(zhì)。其中在膿毒癥大鼠和假手術(shù)組大鼠血清中發(fā)現(xiàn)47個(gè)差異表達(dá)蛋白。與假手術(shù)組相比，膿毒癥大鼠血清中有31個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)升高，16個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)降低。在膿毒癥死亡組與存活組大鼠血清中篩選出28個(gè)差異表達(dá)蛋白。與膿毒癥大鼠存活組相比，死亡組血清中有14個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)升高，14個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)降低。
　　為進(jìn)一步驗(yàn)證iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)的分

6、析結(jié)果，我們采用ELISA方法從上述實(shí)驗(yàn)所發(fā)現(xiàn)的膿毒癥差異表達(dá)蛋白中選出25個(gè)蛋白進(jìn)一步做定量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中21個(gè)蛋白質(zhì)的ELISA結(jié)果和iTRAQ結(jié)果保持一致。為篩選出對(duì)膿毒癥診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)最有價(jià)值的生物標(biāo)志物，我們對(duì)膿毒癥大鼠和假手術(shù)組大鼠血清中25個(gè)差異表達(dá)蛋白的ELISA結(jié)果進(jìn)行了Logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)PTX3、MMRN1、FCN1、CPN2、PRSS1和PF4是與膿毒癥診斷密切相關(guān)的生物標(biāo)志物，根據(jù)這六個(gè)生物標(biāo)志物得出

7、六個(gè)膿毒癥診斷相關(guān)的方程為:Logit P=1.473 PTX3-37.054; Logit P=4.118 MMNR1-39.249; Logit P=0.053 FCN1-52.381; Logit P=0.074 CPN2-21.569; Logit P=9.967 PF4-6.520; Logit P=0.039 PRSS1-4.227。該六個(gè)模型在大鼠膿毒癥診斷中的敏感性、特異性和準(zhǔn)確度均達(dá)到100％。同時(shí)，我們將膿毒癥死亡組

8、和存活組大鼠血清中25個(gè)差異表達(dá)蛋白的ELISA結(jié)果進(jìn)行了Logistic回歸分析，得到了一個(gè)與膿毒癥預(yù)后預(yù)測(cè)相關(guān)的模型:Logit P=-179.688+0.794 MMRN1+1.682 PPBP-0.003 FGα-0.011 FGβ。采用該模型對(duì)膿毒癥大鼠的預(yù)后進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其敏感性為100％，特異性為91.7％。上述研究揭示了一批潛在的新的膿毒癥生物標(biāo)志物，為膿毒癥的臨床診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)提供了新的思路和實(shí)驗(yàn)線索。
　　3、

9、為評(píng)估PTX3在膿毒癥患者診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)中的作用，我們從ICU選擇一批膿毒癥病人進(jìn)行了臨床研究，并將PTX3與傳統(tǒng)的膿毒癥生物標(biāo)志物降鈣素原(PCT)和C-反應(yīng)蛋白(CRP)進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，與SIRS組相比，膿毒癥組血清PTX3、CRP和PCT濃度均升高(P＜0.05);與膿毒癥存活組相比，死亡組的血清PTX3濃度進(jìn)一步升高(P＜0.05)，而血清CRP和PCT濃度升高沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。血清PTX3、CRP、PCT濃

10、度和APACHEⅡ評(píng)分的ROC曲線分析顯示，與傳統(tǒng)的生物標(biāo)志物CRP、PCT和APACHEⅡ評(píng)分相比，PTX3是一個(gè)更有效的膿毒癥診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)的生物標(biāo)志物。PTX3用于膿毒癥診斷時(shí)的ROC曲線下面積為0.963，當(dāng)其濃度高于2.43 ng/ml時(shí)診斷膿毒癥的敏感性和特異性均超過90％; PTX3用于膿毒癥預(yù)后預(yù)測(cè)時(shí)的ROC曲線下面積為0.928，當(dāng)其濃度高于3.16 ng/ml時(shí)預(yù)測(cè)膿毒癥預(yù)后的敏感性和特異性均超過80％。
　　

11、綜上所述，本研究采用iTRAQ標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選出一批與大鼠膿毒癥診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)相關(guān)的生物標(biāo)志物，并選擇最佳生物標(biāo)志物建立了膿毒癥診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)模型，發(fā)現(xiàn)了六個(gè)與膿毒癥診斷相關(guān)的生物標(biāo)志物:PTX3，MMRN1，F(xiàn)CN1，CPN2，PRSS1和PF4，并發(fā)現(xiàn)四個(gè)與膿毒癥預(yù)后預(yù)測(cè)相關(guān)的生物標(biāo)志物:MMRN1，PPBP, FGα和FGβ。經(jīng)臨床研究發(fā)現(xiàn)，PTX3作為膿毒癥診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)的生物標(biāo)志物，其效果優(yōu)于傳統(tǒng)的生物標(biāo)志物PCT和CR