去甲斑蝥素下調抑凋亡家族Bcl-2基因誘導肝癌細胞凋亡的分子機制研究.pdf

1、肝癌是常見的嚴重威脅著人們健康的惡性腫瘤。在我國,原發(fā)性肝癌是占第三位的和癌癥相關死亡因為?；颊呔驮\時多處于中晚期,失去了手術機會。迄今,化療是中晚期肝癌和其他惡性腫瘤的主要治療手段。但是,許多化療藥物在抗癌的同時,對正常細胞也有殺傷作用。一些天然藥物,特別是一些傳統(tǒng)的中草藥,和許多化療藥物相比,具有廣譜抗癌、低毒的優(yōu)點,有望成為治療惡性腫瘤的替代手段。許多研究顯示,許多中草藥含有抗癌的化學活性成分。因此,我們對傳統(tǒng)的中草藥是否存在對治

2、療原發(fā)性肝癌有生物活性成分進行研究。
　　 斑蝥素是從斑蝥中提取出來的一種有效成分,作為一種傳統(tǒng)中草藥被長期應用于疾病的治療中,對肝癌、乳腺癌、胃腸道和結直腸癌等有明顯的治療作用。但由于斑蝥素有嚴重的對胃腸道和尿道粘膜的嚴重的毒副作用,導致其應用受到嚴重的限制。因此,很多人工合成的斑蝥素衍生物應運而生。去甲斑蝥素(Norcantharidin,NCTD)是斑蝥素去甲基后的衍生物,在顯示強烈地抗腫瘤特性外,對于正常細胞具有低毒性的

3、特點。NCTD對胃腸道和尿道粘膜很小的毒性作用和骨髓抑制。早期的研究證明,NCTD的抗腫瘤特點包括抑制細胞增殖、阻滯細胞有絲分裂于G2/M期、通過caspase途徑誘導細胞凋亡而不影響單核血細胞活性。在NCTD處理后,促凋亡和抑凋亡Bcl-2家族蛋白比例增加和細胞凋亡同時被觀察到。這種促/抑凋亡蛋白的比例水平作為細胞凋亡的“開關”作用被長期地認識到。
　　 凋亡是程序性的細胞死亡,包括了一系列生化過程和細胞形態(tài)學特征的改變并最終

4、導致細胞死亡。典型的細胞凋亡形態(tài)學變化包括細胞發(fā)泡、細胞膜的改變如膜的不對稱和粘附性的丟失,核碎裂、細胞體皺縮、染色質濃縮、染色體DNA斷裂。在多細胞生物體,包括人類和大部分動物多種疾病的發(fā)生和凋亡存在缺陷有關。凋亡缺失或不足可導致細胞擴增不受控制,并導致如癌癥的發(fā)生。先前的研究顯示凋亡是化療藥物從事它們的毒性作用和抗腫瘤作用主要機制。此外,近期的研究也顯示凋亡能提高腫瘤對化療藥物的敏感性和化療效果。
　　 目的:
　　

5、 先前的研究顯示,NCTD能誘導體外人結腸癌、口腔癌、惡性膠質瘤細胞等的凋亡。但是,NCTD誘導的肝癌細胞的凋亡機制很少被涉及。因此,在這個實驗中,我們對NCTD誘導肝癌細胞株SMMC-7721、BEL-7402細胞的凋亡機制進行探討。
　　 方法：
　　 對肝癌細胞株SMMC-7721,BEL-7402進行體外培養(yǎng),應用NCTD處理肝癌細胞,采用MTT方法測定肝癌細胞的增殖率,臺盼藍拒染法檢測肝癌細胞的死亡率,Anne

6、xin V/PI雙染,流式細胞儀測定肝癌細胞的凋亡率,蛋白質印跡(Western blot)檢測半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶(caspase)和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)蛋白,以及肝癌細胞的Bcl-2抑凋亡家族基因的表達。實驗數(shù)據(jù)應用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行分析,用(x)±s表示,采用單因素方差分析,用Dunnettt檢驗進行組間比較,以α=0.05作為顯著性檢驗水準。
　　 結果：
　　 MTT檢測顯示NCTD

7、處理24,48和72 h后SMMC-7721細胞IC50分別為12,6和1.6μg/ml,BEL-7402細胞IC50分別為10,4和2μg/ml；臺盼藍拒染法結果顯示,濃度為3μg/ml、10μg/ml、30μg/ml的NCTD處理24 h后,SMMC-7721細胞的死細胞率分別為16.89％、46.16％、72.13％,均顯著高于未處理對照組的死細胞率3.34％(P<0.01)；BEL-7402細胞的死細胞率分別為19.59％、50

8、.10％、90.31％,均顯著高于未處理對照組的死細胞率2.88％(P<0.01)。流式細胞儀檢測顯示,NCTD10μg/ml處理16 h,SMMC-7721細胞凋亡率達到45.25％,較未處理對照組(18.86％)升高26.39％,BEL-7402細胞凋亡率達到41.51％,較未處理對照組(22.29％)升高19.22％；Western blot結果顯示,NCTD10μg/ml處理8、14和24 h后,在兩株肝癌細胞均檢測到caspa