Cx43高表達心肌細胞系的建立及在對抗冷保存損傷中的應用和機制研究.pdf

1、背景
　　 心臟移植手術為嚴重終末期心臟病患者帶來了福音,而減輕供心低溫保存過程中的損傷是心臟移植成功的關鍵,盡管許多研究者對各種心臟保存液的成分及其灌注方式進行了調(diào)整,如添加血漿有效成分、氟碳化合物、氧自由基清除劑、營養(yǎng)基質(zhì)、鈣離子拮抗劑等,這些都不同程度地提高了低溫保存心臟的心功能,但供體心臟保存時間大于6h時,這些改進措施的效果不理想。供心在低溫保存期間細胞凋亡的發(fā)生是制約心臟保存時限的主要因素之一。若能有效地抑制心肌細胞

2、凋亡,就有可能為器官低溫保存提供新的藥物作用靶點,提高供心在長時程低溫保存的有效性,延長供心保存時間,使遠距獲取供心,擴大供心來源成為可能。連接蛋白43(connexin43,Cx43)是心室肌細胞間的一種主要的連接蛋白。以往的研究一直認為,Cx43僅存在于心肌細胞質(zhì)膜上,在心肌細胞膜表面,6個Cx43形成一個連接子,再由相鄰細胞接觸面上的連接子對接而成的縫隙連接通道,該通道主要介導相鄰細胞間的電耦聯(lián)和小分子化學信號分子的傳遞(如K+、

3、Na+、Ca2+、cAMP、IP3等),即心肌細胞間通訊的作用.然而近年的研究發(fā)現(xiàn)Cx43的分布并不局限于細胞質(zhì)膜上,且除了細胞間通訊外還可能存在其他新的功能。
　　 目的
　　 (1)研究Cx43蛋白過表達對冷保存H9c2心肌細胞的保護作用。
　　 (2)探討Cx43蛋白過表達對抗冷保存誘導的心肌細胞損傷的可能機制。
　　 方法
　　 (1)pEGFP-c1-Cx43真核表達載體的構(gòu)建:收集培養(yǎng)

4、的H9c2細胞提取其總RNA,逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。根據(jù)大鼠Cx43基因閱讀開放框(open reading frame,ORF)設計一對引物,并在引物中引入兩個酶切位點EcoRⅠ和BamHⅠ。上游引物:5'TCCAGTCACCCATAGAATTCGAA3',其中下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點,下游引物:5'GTGGATCCTTAAATCTCCAGGT3',其中下劃線部分為BamHⅠ酶切位點。以此為引物,以逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模版,PC

5、R擴增Cx43全長。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析。經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定的PCR產(chǎn)物膠回收后用EcoRⅠ和BamHⅠ分別酶切2小時,進行膠回收。膠回收產(chǎn)物抽干后用T4 DNA Ligase22℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,隨后挑取克隆,酶切鑒定為陽性后,送上海生工生物有限公司測序。
　　 (2)構(gòu)建點突變載體S262A-Cx43:利用定點突變技術,設計包含一對突變位點的引物,上游引物:5'AAAGACTGCGGAGCTC

6、CAAAATACG3';下游引物:5'CGTATTTTGGAGCTCCGCAGTCTTT3'。以構(gòu)建的pEGFP-c1-Cx43為模版,PCR擴增質(zhì)粒全長.將PCR產(chǎn)物用DpnⅠ酶切,消化模板質(zhì)粒。將消化后的PCR產(chǎn)物沉淀,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。所得的質(zhì)粒即為Cx43蛋白磷酸化位點第262位絲氨酸(S)突變成丙氨酸(A)的突變體。
　　 (3)Western blotting:利用Cx43、和p-S262-Cx43抗體觀察各組細

7、胞總Cx43蛋白的表達和S262磷酸化情況。
　　 (4)實驗分組和冷保存處理:分無轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的H9c2細胞組(空白對照組)、空載體組、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了pEGFP-c1-Cx43的H9c2細胞組(Cx43組)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了pEGFP-c1-S262A-Cx43的H9c2細胞組(S262A-Cx43組)。各組細胞在Celsior保存液4℃保存0-48 h后,去Celsior保存液換成DMEM培養(yǎng)基,放入37℃、CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h

8、。
　　 (5)細胞活力測定:取體外培養(yǎng)的H9c2細胞,用MTT法測定冷保存后細胞活力。
　　 (6)LDH測定:測定各組細胞冷保存后培養(yǎng)基中LDH含量。
　　 結(jié)果
　　 (1)酶切和測序結(jié)果表明成功構(gòu)建了pEGFP-c1-Cx43真核表達載體和其262位絲氨酸突變體S262A。
　　 (2)過表達Cx43蛋白對冷保存誘導的H9c2細胞損傷的影響空白對照組細胞低溫保存12-48 h再常溫培養(yǎng)1h

9、后,與低溫保存0 h的細胞相比,細胞存活率明顯降低,LDH釋放量增加(P＜0.05)。與經(jīng)過相同時間低溫保存處理的空白對照組細胞相比,Cx43組細胞的存活率顯著增高,LDH含量顯著下降。
　　 (3)過表達Cx43的H9c2細胞對抗冷保存損傷作用與縫隙連接的形成無關 MTT結(jié)果顯示,不同密度接種的空載體組細胞冷保存后細胞活力均呈時間依賴性降低,而Cx43組細胞即使在低密度接種(Cx43不形成細胞間縫隙連接)的情況下,仍可顯著對抗