基于量子點熒光探針的大腸癌成像研究.pdf

1、目的：
　　大腸癌是常見的惡性腫瘤之一，在我國，該病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。早診斷、早治療是提高大腸癌治愈率的關鍵。目前，我國常用大腸癌診斷方法在靈敏度、特異性和陽性檢出率上都有不盡如人意之處，因此，建立一種無創(chuàng)性、靈敏度高、特異性強的大腸癌檢測技術(shù)對提高該病的治愈率具有重要的意義。
　　量子點—這種新型的熒光染料正在引起人們越來越多的關注。量子點(Quantum dots，QDs)是指直徑為1-10nm的半導體納米顆粒，一

2、般是由Ⅱ-Ⅵ族（如CdSe、CdTe、CdS、ZnSe等）或Ⅲ-Ⅴ族（如InP、InAs等）元素組成。量子點獨特的量子尺寸效應和表面效應使其具有良好的光學特性，因而，成為新型的熒光標記物。與傳統(tǒng)的有機熒光染料相比，量子點具有以下光學特性:(1)量子點的激發(fā)光譜寬且連續(xù)分布，發(fā)射光譜窄且對稱，因此不同的量子點可以實現(xiàn)一元激發(fā)，多色成像;(2)通過改變量子點的化學組成或粒徑大小可改變它的發(fā)射波長，在多色成像時，提高了檢測的“信噪比”，增加了

3、靈敏度。另外，選用發(fā)射波長位于紅外區(qū)的量子點，其產(chǎn)生的“紅光”在組織內(nèi)的穿透力強，更適合在活體動物內(nèi)進行深層組織的成像研究;(3)量子點的Stocks位移大，可避免激發(fā)光的干擾，提高了檢測的靈敏度;(4)量子點的熒光強度高，是普通有機熒光染料的10-20倍，因而檢測的靈敏度高;(5)量子點的抗光漂白能力強，適合進行長時、動態(tài)的生命過程的研究。
　　量子點經(jīng)表面修飾后，可以與抗體分子偶聯(lián)，制備出新型的免疫熒光探針。該熒光探針，即保留

4、了量子點獨特的光學特性，同時義具有抗體分子識別抗原的特異性，因而提高了檢測的特異性和靈敏度，這對建立新型的腫瘤檢測技術(shù)具有重要的意義。
　　LEA(large external antigen)即大腸癌相關抗原，是位于大腸癌細胞表面的一種腫瘤標志物。據(jù)研究表明，LEA具有較強的組織特異性。ND-1是通過雜交瘤技術(shù)制備的抗LEA的單克隆抗抗體;ND-1-scFv是通過基因工程技術(shù)制備的ND-1單鏈抗體ND-1-scFv。同完整抗體N

5、D-1相比，ND-1-scFv具有許多優(yōu)點:(1)分子量小，免疫原性低，用于人體不易產(chǎn)生抗異種蛋白反應;(2)容易進入實體瘤周圍的微循環(huán);(3)血循環(huán)和全身廓清快，半衰期短，腎臟蓄積很少;(4)無Fc段，不易與具有Fc受體的非靶細胞結(jié)合，成像清晰;(5)易于基因操作和基因工程大量生產(chǎn)。由于scFv的這些優(yōu)點，使得其在腫瘤臨床診斷和治療中顯示了巨大的潛力。
　　適配子是通過SELEX(即指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進化，Systematic

6、Evolution ofLigands by Exponential Enrichment，SELEX)技術(shù)制備的單鏈寡聚核苷酸。通過這種方式篩選到的適配子可以特異性地識別靶標分子，并通過其獨特的二級或三級結(jié)構(gòu)與之結(jié)合，因而我們又把適配子稱為“人工抗體”。與抗體蛋白相比，適配子具有一定的優(yōu)勢。(1)適配子可以體外合成，節(jié)約時間和成本;(2)適配子對熱、各種有機試劑及各種pH更穩(wěn)定;(3)適配子的靶標范圍比抗體蛋白更廣泛，從小分子毒素、無

7、機離子到蛋白質(zhì)、整個細胞甚至組織;(4)由于適配子通過體外合成，免疫原性低，可以實現(xiàn)更高效、更安全的體內(nèi)靶向標記和治療。正是適配子的這些優(yōu)點，使其在腫瘤診斷和治療中有著越來越多的應用。
　　本研究分別采用EDC和NHS介導的共價偶聯(lián)法和生物素—鏈霉親和素介導的非共價偶聯(lián)法將量子點QDs與單克隆抗體ND-1、單鏈抗體ND-1-scFv偶聯(lián)，成功制備檢測大腸癌細胞相關抗原LEA的特異性熒光探針，實現(xiàn)對大腸癌細胞、病理組織高靈敏度檢測;

8、進一步的荷瘤裸鼠體內(nèi)靶向標記研究結(jié)果表明單鏈抗體量子點探針在動物體內(nèi)也具有較高的標記特異性;以EDC和NHS為共價偶聯(lián)劑，制備適配子BC15-QD熒光探針，實現(xiàn)對細胞和病理組織表達的靶標蛋白的特異性標記。本研究可望為大腸癌早期診斷提供新的檢測技術(shù)。
　　方法：
　　一、單克隆抗體(ND-1)量子點探針的制備及對大腸癌相關抗原LEA的特異性檢測
　?。ㄒ唬┥锼亟閷У膯慰寺】贵wND-1量子點探針的制備及對LEA的特異性檢

9、測
　　經(jīng)雜交瘤技術(shù)制備、純化單克隆抗體ND-1;并與生物素反應，制備生物素化的ND-1(ND-1-Biotin)。通過生物素—鏈霉親和素的特異性結(jié)合，將生物素化的單克隆抗體ND-1與鏈霉親和素標記的量子點(SA-QD)非共價偶聯(lián)，利用免疫熒光成像技術(shù)，考察SA-QD探針對高表達LEA的大腸癌細胞系CCL187靶向標記能力。通過單克隆抗體ND-1與ND-1-Biotin的免疫競爭標記實驗，利用LSCM檢測熒光強度的變化，進一步考察

10、SA-QD探針對LEA的標記特異性。
　　利用免疫熒光標記技術(shù)，將QD-SA探針分別與大腸癌細胞系CCL187、HT29和CloneA孵育，利用熒光顯微鏡下觀察量子點熒光信號;進一步利用FCM對量子點標記后的三種細胞的熒光強度進行定量分析，以考察ND-1-Biotin、SA-QD在細胞水平上對LEA表達水平的定性、定量檢測。
　　通過免疫熒光組化技術(shù)對53例分化程度不同的大腸癌病理組織切片進行檢測，考察ND-1-Biotin

11、、SA-QD對病理組織表達的LEA靶向標記的能力。
　?。ǘ〦DC和NHS介導的ND-1量子點探針（ND-1-QD）的制備及對LEA的特異性檢測
　　量子點經(jīng)EDC和NHS活化后，與一定濃度的抗體蛋白共價反應實現(xiàn)偶聯(lián)。本實驗對量子點與抗體蛋白反應的摩爾比例（1∶20、1∶40和1∶80）進行了考察，利用瓊脂糖電泳對偶聯(lián)效果進行檢測，優(yōu)化共價偶聯(lián)條件。
　　利用免疫熒光細胞技術(shù)，考察ND-1-QD對靶細胞特異性標記的能

12、力。
　　二、單鏈抗體(ND-1-scFv)量子點探針的制備及對大腸癌相關抗原LEA的特異性檢測
　　通過基因工程技術(shù)，制備完整抗體ND-1的單鏈抗體ND-1-scFv，利用SDS-PAGE電泳鑒定抗體的純度;利用免疫熒光技術(shù)考察抗體的免疫結(jié)合活性。
　　結(jié)果：
　　一、單克隆抗體(ND-1)量子點探針的制備及對大腸癌相關抗原LEA的特異性檢測
　　純化后單克隆抗體ND-1與生物素反應后，制備生物素化抗體N

13、D-1-Biotin。
　　經(jīng)免疫熒光技術(shù)檢測，在靶細胞CCL187細胞膜上顯示清晰的紅色熒光，背景及細胞質(zhì)、核內(nèi)無非特異性信號;在免疫競爭實驗中，在LSCM下觀察到隨競爭性ND-1的濃度增加，量子點的熒光強度逐漸減弱;LSCM半定量分析與觀察到的結(jié)果一致。這說明ND-1-Biotin、SA-QD能夠?qū)崿F(xiàn)對LEA的特異性檢測。
　　對53例分化程度不同的大腸癌病理切片免疫組化檢測結(jié)果顯示，ND-1-Biotin、SA-QD能

14、夠?qū)崿F(xiàn)對組織切片表達的LEA的特異性檢測;同其他研究者采用的免疫組化技術(shù)檢測結(jié)果相比，基于量子點的免疫熒光組化技術(shù)陽性檢測率略有提高;對檢測結(jié)果分析表明，量子點標記的熒光信號的強弱與分化程度有關，而相關研究表明LEA的表達水平與分化程度相關，提示可以利用該技術(shù)通過對LEA的標記，進行病理診斷的定量檢測。
　?。ǘ〦DC和NHS介導的量子點探針（ND-1-QD）的制備及對LEA的特異性檢測
　　通過瓊脂糖電泳對偶聯(lián)產(chǎn)物電泳遷

15、移率的比較，結(jié)果顯示，當量子點與抗體摩爾比為1∶40時，二者能夠有效偶聯(lián)，選擇該條件進行后續(xù)實驗。
　　利用熒光分光光度計對偶聯(lián)產(chǎn)物的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜進行掃描，結(jié)果顯示量子點偶聯(lián)產(chǎn)物的譜峰位置與游離量子點一致，即仍然保持原有的熒光特性。
　　ND-1-QD偶聯(lián)產(chǎn)物被激發(fā)光源持續(xù)照射1h后，熒光強度幾乎沒有發(fā)生變化，這說明與蛋白偶聯(lián)后，量子點仍具有很強的抗漂白能力。
　　將ND-1-QD與LEA高表達的靶細胞CCL18

16、7孵育后，熒光顯微鏡觀察可見細胞膜上清晰的紅色熒光，細胞內(nèi)及背景上無非特異性熒光，這說明共價偶聯(lián)法制備的ND-1-QD能夠?qū)崿F(xiàn)對LEA的特異性檢測。
　　二、單鏈抗體(ND-1-scFv)量子點探針的制備及對大腸癌相關抗原LEA的特異性檢測
　　利用基因工程技術(shù)制備ND-1的單鏈抗體ND-1-scFv，經(jīng)SDS-PAGE電泳灰度掃描顯示抗體的純度高達95％，經(jīng)間接免疫熒光技術(shù)顯示該單鏈抗體具有較強的免疫結(jié)合活性。
　　

17、免疫熒光技術(shù)顯示，當量子點與單鏈抗體的摩爾比為1∶50時，偶聯(lián)反應較為充分，背景及細胞內(nèi)無非特異性信號。
　　熒光分光光度計掃描偶聯(lián)產(chǎn)物的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，與游離量子點比較，結(jié)果顯示與蛋白偶聯(lián)后，量子點的激發(fā)譜線和發(fā)射譜線幾乎沒有改變，峰高略有增加。
　　結(jié)論：
　　1、本研究成功制備了抗人大腸癌單克隆抗體ND-1與單鏈抗體ND-1-scFv的量子點探針，并在細胞、病例組織切片、荷瘤裸鼠等不同層面上證明ND-1-QD