細(xì)胞因子在塵肺病中的表達(dá)及其意義.pdf

1、背景與目的 塵肺病(pneumoconiosis)目前在我國接塵工人中仍然發(fā)病率較高、危害較嚴(yán)重，而且對(duì)其尚無有效的治療手段。通過研究，篩選出能夠反映接塵工人暴露及效應(yīng)的生物標(biāo)志物，對(duì)于接塵工人的早期預(yù)警、健康監(jiān)護(hù)及生物監(jiān)測(cè)，提高塵肺病的預(yù)防控制水平，具有重要的實(shí)際意義。 大量資料表明，多種細(xì)胞因子參與了纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程，其中轉(zhuǎn)化生長因子β 1(transforming growth factor betal，TG

2、F-β1)、血小板源性生長因子(platelet derived growth factor,PDGF)和結(jié)締組織生長因子(connective tissue growthfactor,CTGF)等對(duì)調(diào)控肺成纖維細(xì)胞的分裂、增殖及膠原蛋白的合成與降解起著十分重要的作用。 FGF-β1是一類多效性多肽，其生物學(xué)活性十分廣泛，主要促進(jìn)問質(zhì)來源細(xì)胞的增殖、分化和移行等功能，如促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，增加成纖維細(xì)胞分泌纖粘素和膠原等細(xì)胞外基

3、質(zhì)等。它既能正調(diào)控又能負(fù)調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等生物過程。TGF-β1參與纖維化過程的發(fā)生已經(jīng)明確，其中包括肝纖維化、肺纖維化、腎纖維化、皮膚纖維化等，且研究者所在研究小組發(fā)現(xiàn)TGF-β1與煤工塵肺的發(fā)生發(fā)展可能有著密切的關(guān)系；CTGF的表達(dá)在多種纖維化疾病中有上調(diào)現(xiàn)象，可能僅次于TGF-β1的產(chǎn)生量。Inkinen K等在大鼠創(chuàng)傷愈合模型實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，原位雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞高表達(dá)CTGF；該大鼠創(chuàng)傷愈合模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明

4、CTGF的表達(dá)和TGF-β1、PDGF一起在創(chuàng)傷愈合過程中都是上調(diào)的，且CTGF在mRNA和蛋白兩方面的表達(dá)均與TGF-β1和PDGF的表達(dá)相關(guān)；另在腎小球體外實(shí)驗(yàn)中TGF-β1通過Smad2信號(hào)傳導(dǎo)通路來調(diào)節(jié)CTGF的表達(dá)。這些研究都提示TGF-β1、CTGF和PDGF三者在纖維化發(fā)生發(fā)展過程中有著一定的相關(guān)關(guān)系。TGF-β1在以往的器官纖維化中已經(jīng)研究較多,與塵肺病關(guān)系的也有一定研究，但具體的作用機(jī)制不清楚。而CTGF和PDGF與器

5、官纖維化的關(guān)系有一定的研究，但其與塵肺病的關(guān)系尚未見報(bào)道。此研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人群調(diào)查研究兩個(gè)方面，采用RT-PCR(reverse transcription- polymerase chain reaction)、免疫組織化學(xué)和ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)等技術(shù)，從基因及其蛋白兩個(gè)層次同時(shí)來觀察分析CTGF、TGF-β1和：PDGF三個(gè)細(xì)胞因子在塵肺病發(fā)生發(fā)展過程中的表達(dá)水平及其意

6、義，探討細(xì)胞因子在塵肺發(fā)病中的作用和機(jī)制，為研究塵肺的接觸和效應(yīng)生物標(biāo)志物提供理論依據(jù)，為進(jìn)一步改進(jìn)塵肺病的預(yù)警和健康監(jiān)護(hù)提供可能的理論依據(jù)。 1 CTGF、TGF-β1和PDGF在大鼠塵肺組織中的表達(dá)水平及其意義1.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕ⅲ哼x用河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的SPF健康成年SD大鼠40只，合格證號(hào)為豫動(dòng)字410117號(hào)，體重185～212g，健康狀況良好，隨機(jī)將動(dòng)物分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。用準(zhǔn)備好的石英粉塵懸液采用支氣管灌注法

7、進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷闹苽?。大鼠染塵后45天處死，剪下肺臟，用生理鹽水沖洗干凈，大部分放入液氮罐保存，小部分用體積分?jǐn)?shù)為10％的中性福爾馬林灌注固定。 1.2 實(shí)驗(yàn)方法： 采用提總RNA試劑盒提取大鼠肺組織標(biāo)本RNA，通過1％瓊脂糖凝膠電泳及RNA的OD值評(píng)估RNA的含量和純度；使用上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司的AMV第一鏈cDNA合成試劑盒進(jìn)行cDNA的反轉(zhuǎn)錄；RT-PCR擴(kuò)增β-actin檢測(cè)逆轉(zhuǎn)錄效果；采用RT-P

8、CR和免疫組織化學(xué)方法分別對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)組中的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中大鼠體內(nèi)CTGF、TGF-β1和PDGF的基因表達(dá)量和三種基因編碼蛋白表達(dá)量進(jìn)行分析；統(tǒng)計(jì)學(xué)分析中數(shù)據(jù)以x±S表示；兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，3個(gè)細(xì)胞因子間相關(guān)關(guān)系采用皮爾遜相關(guān)分析；檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。采用Biosens Digital Imaging System圖象分析系統(tǒng)對(duì)免疫組織化學(xué)結(jié)果進(jìn)行半定量分析，最后用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)半定量結(jié)果進(jìn)行分析；3個(gè)細(xì)胞因子的

9、蛋白表達(dá)量間相關(guān)關(guān)系采用皮爾遜相關(guān)分析；檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。 1.3 結(jié)果：通過對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭蠧TGF、TGF-β1和PDGF基因表達(dá)與蛋白表達(dá)結(jié)果的分析，CTGF、TGF-β1和PDGF基因在實(shí)驗(yàn)組大鼠肺組織中的表達(dá)量高于對(duì)照組大鼠肺組織中的表達(dá)量；CTGF、TGF-β1和PDGF表達(dá)量之間在基因和蛋白兩方面均呈正相關(guān)。 2塵肺病患者血清中TGF-β1、PDGF和CTGF表達(dá)水平變化及其意義 2.1 調(diào)查對(duì)象

10、： 病例組：由河南省職業(yè)病防治研究所和平頂山煤業(yè)集團(tuán)職業(yè)病醫(yī)院按《塵肺X線診斷標(biāo)準(zhǔn)》(GBZ70-2002)<'[2]>確診的河南省平頂山市和許昌市男性無塵肺0<'+>5例和65例塵肺病患者共70例，其中矽肺病患者24例，煤工塵肺病患者41例，均無免疫系統(tǒng)疾病和其它纖維化性疾病。平均年齡為65.50±5.44歲，接塵年限為26.41±6.38年，主要工種為采礦工、掘進(jìn)工等高接塵工種。 對(duì)照組：77例男性醫(yī)院健康體檢者，無

11、粉塵接觸職業(yè)史，均排除心、腦、肝、腎、肺等臟器的器質(zhì)性及纖維化性疾病，平均年齡為60.08±8.24歲。 2.2 調(diào)查方法： 問卷調(diào)查：每位調(diào)查對(duì)象均接受問卷調(diào)查，內(nèi)容包括：個(gè)人一般情況、粉塵作業(yè)史、塵肺病診斷史、既往病史和家族史等；血樣采集：全部研究對(duì)象取清晨空腹靜脈血，離心分離血清，4℃保存?zhèn)溆?；血清TGF-β1、CTGF和PDGF濃度的檢測(cè)：采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行：統(tǒng)計(jì)學(xué)分

12、析：應(yīng)用Excel 2000對(duì)全部調(diào)查和測(cè)定結(jié)果建立數(shù)據(jù)庫，SPSS 13.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。 2.3 結(jié)果：無塵肺0<'+>組血清TGF-β1、CTGF和PDGF含量分別高于塵肺病各期和正常對(duì)照組；病例組塵肺病患者血清TGF-β1、PDGF含量均高于對(duì)照組；塵肺病患者血清TGF-β1、PDGF含量隨著期別的增加而降低，血清CTGF含量隨著期別的升高而增加。病例組塵肺病患者血清中TGF-β1與PD