血小板生成素受體（Mpl）與其新配體hNUDC相互依賴關系及其功能研究.pdf

1、血小板生成素(Thrombopoitin，TPO)是刺激巨核細胞增殖與分化的主要細胞因子，通過其受體Mpl的結合作用調節(jié)血小板生成。但是研究表明，在TPO基因敲除的小鼠中，巨核細胞和血小板雖然減少90﹪，但小鼠仍然正常發(fā)育，這提示除TPO外，還有其他的代償機制或有未發(fā)現(xiàn)的Mpl配體蛋白存在，與TPO一起調節(jié)血小板生成。 本實驗室利用酵母雙雜交系統(tǒng)(Yeast two hybrid system)，以Mpl的胞外區(qū)域為誘餌，篩選人

2、胎肝cDNA文庫，獲得的一個與Mpl相互結合的蛋白，序列分析表明該蛋白為人核遷移蛋白hNUDC。通過一系列的體內體外實驗，證明該蛋白為Mpl的另一枚配體。 為了進一步確定Mpl與TPO、hNUDC兩個配體的結合部位，本實驗根據Mpl結構特點進行缺失突變，構建酵母雙雜交系統(tǒng)及融合熒光蛋白的真核表達載體，分別在酵母細胞和哺乳動物細胞中進行了實驗。在酵母雙雜交系統(tǒng)中，將Mpl系列區(qū)克隆在酵母雙雜交系統(tǒng)誘餌質粒pGBKT7上，將TPO及

3、hNUDC克隆于pGADT7上，在釀酒酵母菌株AH109中進行酵母雙雜交反應。對報告基因的檢測表明，Mpl的兩個配體TPO及hNUDC均與Mpl的CRM1中靠近細胞膜端。同時用構建的缺失Mpl膜外相關區(qū)、融合綠色熒光蛋白(EGFP)表達載體，hNUDC、TPO融合紅色熒光蛋白(DsRed1)表達載體，共轉染NIH3T3細胞、穩(wěn)定表達Mpl特異區(qū)蛋白的NIH3T3細胞進行ELISA、免疫共沉淀研究，進一步確定TPO、hNUDC與Mpl結合

4、部位在Mpl-D1-S2區(qū)，與酵母雙雜交結果一致。該區(qū)域含有造血細胞因子受體的特征氨基酸序列Trp-Ser-Xaa-Trp-Set(即WSXWS box)的退化序列WGXWS及一段Mpl特異的序列“插入區(qū)”，表明WGXWS序列以及插入區(qū)對Mpl與配體的結合起關鍵的作用。確定hNUDC、TPO與Mpl作用部位后，我們以NIH3T3細胞作為模式細胞，用hNUDC蛋白體外處理無血清培養(yǎng)的、穩(wěn)定表達Mpl、Mpl-D1、Mpl-D2、Mpl-D

5、1-S1、Mpl-D1-S2、EGFP的NIH3T3細胞，MTT法分析hNUDC蛋白對細胞活力影響，結果發(fā)現(xiàn)，hNUDC蛋白可以提高穩(wěn)定表達Mpl、Mpl-D1、Mpl-D1-S2的NIH3T3細胞活力。為了進一步研究hNUDC與Mpl及不同區(qū)域蛋白的相互影響作用，用融合綠色熒光蛋白基因的pMpl-EGFP、pMpl-D1-EGFP、pMpl-D1-S2-EGFP真核表達載體DNA與融合紅色熒光蛋白基因的phNUDC-DsRed1真核表

6、達載體DNA共轉染NIH3T3細胞，以及利用hNUDC蛋白進一步體外處理穩(wěn)定表達Mpl、Mpl-D1、Mpl-D1-S2蛋白的Mpl-EGFP-NIH3T3細胞、Mpl-D1-EGFP-NIH3T3細胞及Mpl-D1-S2-NIH3T3細胞，結果表明，hNUDC可以改變穩(wěn)定表達Mpl、Mpl-D1、Mpl-D1-S2蛋白的NIH3T3細胞的細胞形態(tài)，形成巨核、多核，使細胞具有巨核細胞分化的一些特征；hNUDC蛋白體外可以誘導穩(wěn)定表達Mp

7、l、Mpl-D1、Mpl-D1-S2蛋白的NIH3T3細胞ERK、P38蛋白磷酸化，引起ERK、P38信號轉導作用。用phNUDC-DsRedl載體轉染表達Mpl的NIH3T3細胞，用高爾基體、內質網及微管熒光抗體標記高爾基體、內質網和微管，發(fā)現(xiàn)Mpl可以通過內質網及微管系統(tǒng)介導hNUDC蛋白的分泌作用。共轉染也發(fā)現(xiàn)Mpl-D1-S2能介導hNUDC蛋白的分泌作用。 總之，本論文確定了hNUDC、TPO與Mpl的結合部位，研究了