失血性休克后Pyrin在肺NLRP3炎癥小體活化中的作用及機制研究.pdf

1、失血性休克(Hemorrhagic shock，HS)能夠通過啟動機體固有免疫系統(tǒng)，觸發(fā)全身炎癥反應，甚至導致多器官功能障礙綜合征(Multiple organ dysfunctionsyndrome，MODS)的發(fā)生。這一病理過程中，炎癥啟動的機理尚不明了。IL-1β在休克后全身炎癥反應綜合征（Systemic inflammatory response syndrome，SIRS）中有著重要的作用，炎癥小體控制著IL-1β的成熟和釋

2、放。Pyrin蛋白由781個氨基酸組成，通過與核苷酸結合寡聚化域樣受體蛋白(Nucleotide-binding oligomerizationdomain-like receptor protein，NLRP)相互作用，可以抑制炎癥小體的活化。內(nèi)毒素(Lipopolysaccharide，LPS)以及細胞因子能夠誘導Pyrin蛋白表達增加;在巨噬細胞，白細胞介素(Interluekin-10，IL-10)能夠誘導Pyrin的表達上調(diào)。

3、本課題試圖證實失血性休克后， IL-10水平下調(diào)，Pyrin表達降低，炎癥小體的活化失去負向調(diào)控，進而IL-1β在肺臟內(nèi)的成熟及分泌增加，炎癥反應過程進一步被放大。研究結果顯示，LPS在肺內(nèi)激活了NLRP3炎癥小體的同時，也通過誘導IL-10上調(diào)了Pyrin的表達，抑制了炎癥小體的活化。更為重要的是，LPS介導的IL-10能夠上調(diào)Pyrin表達，在炎癥后期，Pyrin通過抑制炎癥小體活化，控制了炎癥反應的發(fā)展。失血性休克后，IL-10在

4、肺巨噬細胞（Alveolar macrophages，AM）內(nèi)的表達減少，Pyrin在AM以及肺內(nèi)皮細胞中表達降低，進而炎癥小體活化增強，IL-1β分泌增加。本課題提出并闡釋了新的失血性休克后炎癥反應啟動機制:失血性休克抑制了LPS介導的NLRP3炎癥小體活化和IL-1β分泌的負反饋調(diào)節(jié)機制。
　　 第一部分:失血性休克增強內(nèi)毒素誘導的肺組織內(nèi)NLRP3炎癥小體活化
　　 1.內(nèi)毒素誘導的肺組織內(nèi)NLRP3炎癥小體活化能

5、夠被失血性休克所增強通過測定NLRP3和ASC的結合以及caspase-1的剪切成熟來判斷肺內(nèi)炎癥小體的活化情況。通過野生型及NLPR3-/-小鼠，在失血性休克復蘇后2小時氣管內(nèi)給予LPS或生理鹽液注射，應用免疫共沉淀及免疫印跡方法測定肺組織NLRP3及ASC的結合以及caspase-1的剪切成熟，ELISA方法測定肺泡灌洗液中IL-1β水平。結果表明，失血性休克通過激活NLPR3-/-炎癥小體從而增加了IL-1β的成熟、分泌。

6、　　 2.肺巨噬細胞在肺組織炎癥小體活化中起主要作用
　　 為明確肺巨噬細胞在肺組織的炎癥小體活化中所起的作用，小鼠失血性休克復蘇2小時后進行肺泡灌洗，利用免疫磁珠分離系統(tǒng)純化得到肺巨噬細胞。肺巨噬細胞體外給予LPS刺激(1μg/ml)，測定炎癥小體活化、caspase-1剪切成熟及IL-1β的釋放。相比假手術組，在失血性休克組來源的肺巨噬細胞中，給予LPS刺激后，發(fā)生了更為顯著的NLRP3和ASC結合、caspase-1剪切

7、以及IL-1β釋放。LPS誘導的肺組織及肺巨噬細胞內(nèi)NLRP3炎癥小體活化能夠被失血性休克所增強。
　　 第二部分:失血性休克與Pyrin蛋白對肺組織炎癥小體活化的作用機制研究
　　 1.失血性休克損害了肺內(nèi)Pyrin蛋白表達上調(diào)
　　 Pyrin蛋白被認為能夠抑制caspase-1活化及IL-1β成熟釋放(13，20)。為明確失血性休克后，Pyrin蛋白對肺內(nèi)炎癥小體活化的調(diào)節(jié)，首先測定了失血性休克和/或LPS

8、刺激后Pyrin蛋白在肺組織及巨噬細胞內(nèi)的表達水平。在HS-LPS“兩次打擊”后，失血性休克明顯降低了Pyrin蛋白在肺內(nèi)的表達。小鼠肺巨噬細胞體外LPS刺激后，得到了類似的結果:LPS刺激后，假手術組來源的肺巨噬細胞Pyrin蛋白表達上調(diào)，而失血性休克組，失血性休克明顯削弱了LPS誘導的Pyrin表達增加。
　　 2.失血性休克通過削弱IL-10產(chǎn)生抑制了Pyrin蛋白表達
　　 有文獻報道，IL-10可以通過Jak3

9、，Stat6以及NF-κB途徑來誘導Pyrin蛋白的表達(20)。我們先前研究已經(jīng)證明失血性休克降低了IL-10的表達，從而肺部炎癥反應加重(29)。本研究中，我們進一步證實，通過TLR4及MyD88信號通路，LPS誘導了IL-10的肺內(nèi)表達。在假手術和失血性休克組，外源性IL-10明顯誘導了Pyrin蛋白在肺內(nèi)的表達;重組IL-10與LPS復合注射，誘導了更高的表達量;而給予IL-10中和性抗體，無論假手術組或失血性休克組，Pyrin

10、蛋白表達未見增加。以上研究表明，IL-10表達上調(diào)受損，導致了HS-LPS“兩次打擊”后Pyrin蛋白表達上調(diào)被抑制，炎癥晚期更為明顯。
　　 3.Pyrin蛋白表達減少導致了失血性休克介導的炎癥小體激活
　　 為論證IL-10、Pyrin蛋白以及NLRP3炎癥小體之間的關系，我們運用了siRNA技術，使鼠肺血管內(nèi)皮細胞(Mouse lung vascular endothelial cell，MLVEC)內(nèi)Pyrin蛋

11、白表達沉默。轉染后48小時，在LPS或IL-10誘導下，MLVEC細胞中Pyrin蛋白表達明顯受損，LPS誘導的NLRP3-ASC結合明顯增加，caspase-1剪切以及IL-1β釋放也明顯增加。Pyrin蛋白敲除后，即使給予外源性重組IL-10，MLVEC細胞的炎癥小體活化及IL-1β釋放并未減少，提示IL-10降低炎癥小體活化的作用是通過Pyrin蛋白介導的。
　　 綜上所述，我們獲得以下結論:
　　 1.失血性休克

12、能夠增強LPS誘導的肺部炎癥小體活化;
　　 2.肺巨噬細胞在肺組織炎癥小體活化中起主要作用;
　　 3.失血性休克后抑炎因子IL-10表達受損，導致肺部炎癥增強;
　　 4.失血性休克通過削弱IL-10產(chǎn)生從而抑制了Pyrin蛋白表達;
　　 5.Pyrin蛋白表達減少導致了失血性休克介導的炎癥小體激活。
　　 本研究揭示了失血性休克致炎的新的機制，失血性休克通過抑制了LPS刺激后的炎癥小體活化