TIMP1在結(jié)直腸癌中的作用及其調(diào)控機制研究.pdf

1、研究背景和目的:腫瘤是人類健康的最大危害因素之一，隨著世界人口的增長和老齡化的加劇，全球癌癥負擔持續(xù)增加。據(jù)GLOBOCAN估計，2008年大約有1270萬新發(fā)癌癥病例和760萬死亡病例。結(jié)直腸癌作為男性中第三大常見的腫瘤，女性中第二常見的腫瘤，在過去的幾年里，伴隨外科手術、放化療、分子靶向生物治療的進步和疾病的早期檢測，結(jié)直腸癌的生存預后得到了顯著提高。但結(jié)直腸癌患者的長期預后仍然令人失望，特別是晚期大腸癌的5年總生存率只有19％或更

2、低。
　　 已證實結(jié)直腸癌的發(fā)生與諸多癌基因和抑癌基因及其產(chǎn)物的表達或結(jié)構(gòu)異常密切相關，從細胞分子水平深入研究結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展機制，特別是從基因水平上研究尋找結(jié)直腸癌相關基因，對結(jié)直腸癌的診斷、治療和預防發(fā)揮著重要的作用。因此，首先利用基因芯片技術檢測了4例結(jié)直腸腺癌原發(fā)腫瘤組織和配對的4例腹膜轉(zhuǎn)移組織全基因組mRNA表達水平的差異，通過與原發(fā)腫瘤組織的比較，篩選出表達差異顯著的候選基因。鑒于文獻學習和預實驗結(jié)果，最終把注意力

3、集中在了基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1(TIMP1)基因。接著，應用免疫組織化學方法檢測了112例結(jié)直腸癌組織中TIMP1蛋白的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TIMP1蛋白在結(jié)直腸癌組織中亦高表達。于是探討了TIMP1的表達水平與大腸癌標本的臨床病理資料、患者生存期的關聯(lián)性。為進一步驗證TIMP1在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用，應用MTT細胞生長曲線、克隆形成、細胞轉(zhuǎn)移等實驗方法檢測了TIMP1基因?qū)Y(jié)直腸癌細胞的增殖、腫瘤球形成能力、細胞轉(zhuǎn)移侵襲能力

4、和大腸癌細胞對5-FU藥物敏感性的影響。腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移復發(fā)作為導致癌癥患者最常見的死亡原因，因此深入探討了TIMP1對結(jié)直腸癌細胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響及對EMT相關轉(zhuǎn)錄因子的表達水平的影響。此外，通過Targetscan，miRanda和PicTar4三個miRNA生物信息分析網(wǎng)站，預測了靶向調(diào)控TIMP1表達的潛在miRNAs，三種預測結(jié)果均顯示miR-618同TIMP1的3'UTR存在互補的堿基序列結(jié)合位點。于是應用雙熒光素酶報告基

5、因和Western blot等分子生物學方法，進一步研究了miR-618對TIMP1表達水平的調(diào)控及機制。原位雜交和免疫組織化學方法檢測分析miR-618和TIMP1在結(jié)直腸癌組織表達量及其相互關聯(lián)性。通過上述研究，讓我們深入了解了TIMP1在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的致癌作用及其涉及的分子調(diào)控機制，為早期診斷、治療和預防結(jié)直腸癌提供了新的策略和理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 第一章選取結(jié)直腸癌伴腹膜種植轉(zhuǎn)移病人4例，提

6、取原發(fā)腫瘤組織和腹膜轉(zhuǎn)移組織RNA，高通量基因芯片技術對結(jié)腸癌樣本進行基因表達譜分析;免疫組織化學方法檢測TIMP1在結(jié)直腸癌組織中的表達模式，并評價TIMP1表達水平與標本的臨床病理資料的關聯(lián)性，分析其表達水平與結(jié)直腸癌患者生存期預后的關系。
　　 第二章鑒于TIMP1與腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移、臨床分期及患者生存期具有顯著相關性，本課題進一步深入研究了TIMP1對結(jié)直腸癌細胞的生物學行為的影響。首先，針對TIMP1基因的開放讀碼框

7、序列設計了si-RNA。轉(zhuǎn)染si-RNA至SW-620細胞中，采用Western blot和免疫熒光評估si-RNA干擾TIMP1基因表達的效率。接著，通過MTT生長曲線、克隆形成實驗和細胞轉(zhuǎn)移實驗、重組基底膜侵襲實驗檢測了TIMP1表達水平的變化對結(jié)直腸癌細胞的增殖、腫瘤球形成及細胞轉(zhuǎn)移侵襲能力的影響。同時MTT法檢測了si-TIMP-1-SW-620細胞對5-FU耐藥性的影響。
　　 第三章針對TIMP1能夠促進結(jié)直腸癌細胞

8、轉(zhuǎn)移侵襲的特征，利用RT-PCR和Western blot檢測了si-RNA對MT1-MMP表達水平的作用。同時為了驗證TIMP1對結(jié)直腸癌細胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用，我們應用Western blot測定了TIMP1的表達下調(diào)對上皮標記物E-cadherin和間充質(zhì)標記物Vimentin表達量的影響。為進一步明確引起上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的機制，Western blot檢測了與EMT相關的標記物ZEB1、ZEB2和Sail1。
　　

9、第四章應用Targetscan、miRanda和PicTar4三個生物信息分析網(wǎng)站，預測了可能調(diào)控人源TIMP1表達的潛在miRNAs。三個網(wǎng)站預測結(jié)果均顯示miR-618同TIMP13'UTR有結(jié)合位點。將miR-618轉(zhuǎn)染至SW-620細胞，QRT-PCR檢測miR-618在miR-618/SW-620和NC/SW-620兩處理組細胞中的表達水平。同時將miR-618轉(zhuǎn)染至SW-620細胞，Western blot和免疫熒光檢測mi

10、R-618/SW-620和NC/SW-620兩組細胞的TIMP1蛋白表達情況。構(gòu)建含有TIMP1編碼區(qū)全長序列的雙熒光報告基因載體(pTIMP1-CDS)，測序驗證插入片段的序列正確與否。將pTIMP1-CDS質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到SW-620和293T細胞并分別經(jīng)miR-618模擬物或抑制物處理，應用雙熒光報告基因檢測經(jīng)不同處理后的細胞的熒光素變化。應用原位雜交、免疫組織化學方法和QRT-PCR分別檢測38例結(jié)直腸癌組織中TIMP-1和miR-6

11、18表達，并對結(jié)直腸癌組織中miR-618和TIMP-1表達水平相關性作分析。
　　 統(tǒng)計學處理采用統(tǒng)計軟件SPSS13.0對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學處理和分析，計量資料以均數(shù)±標準差（(x)±s）表示。TIMP1的表達與臨床病理資料的關系采用卡方檢驗分析;生存分析采用Kaplan-Meier法，log-rank檢驗比較生存差異。腫瘤球數(shù)量的比較采用兩獨立樣本T檢驗。臨床樣本中miR-618和TIMP1關系采用卡方檢驗分析。P＜0.0

12、5被認為有統(tǒng)計學差異。
　　 結(jié)果:
　　 第一章利用高通量基因芯片技術對原發(fā)腫瘤組織和腹膜轉(zhuǎn)移組織樣本進行基因表達譜分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在腹膜轉(zhuǎn)移組織中表達上調(diào)大于4倍的基因有24個，其中TIMP1基因在腹膜轉(zhuǎn)移組織中明顯高于原發(fā)腫瘤組織，高4.49倍。應用免疫組織化學方法檢測112例結(jié)直腸癌組織中TIMP1蛋白表達，結(jié)果顯示TIMP1在癌細胞漿中表達，陰性表達10例(8.9％)，低表達26例(23.2％)，中度表達42例(

13、37.5％)，強表達34例(30.4％)。通過免疫組化結(jié)果結(jié)合臨床資料，分別分析了腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移、臨床分期與TIMP1表達的關系，發(fā)現(xiàn)TIMP1表達高低與腫瘤大小(P=0.000)、淋巴轉(zhuǎn)移(P=0.001)、臨床分期(P=0.004)具有顯著相關性。通過Kaplan-Meier法分析了TIMP1的表達與結(jié)直腸癌患者生存預后的關系，112例結(jié)直腸癌患者全部接受了隨訪，結(jié)果顯示，TIMP1的表達越高，中位生存時間越短;相反，表達越低，

14、中位生存時間越長。
　　 第二章 siRNA-TIMP1小分子轉(zhuǎn)染SW-620細胞，Western blot和免疫熒光檢測siRNA對TIMP1干擾效率，結(jié)果顯示:相對于對照組，轉(zhuǎn)染siRNA-TIMP1的SW-620細胞明顯低表達TIMP1蛋白。采用MTT法連續(xù)4d觀察si-TIMP1/SW-620細胞增殖速度，結(jié)果顯示從第二天開始低表達TIMP1的SW-620細胞增殖速度減慢;表明si-TIMP1/SW-620較NC/SW-

15、620細胞增殖能力弱。以不同濃度梯度的5-FU分別作用于NC/SW-620和si-TIMP1/SW-62072h，結(jié)果顯示兩組細胞IC50有明顯差異，si-TIMP1/SW-620較NC/SW-620耐藥性明顯降低。進一步將NC/SW-620和si-TIMP1/SW-620細胞分別培養(yǎng)在無血清培養(yǎng)基中，腫瘤球生長5d后，兩獨立樣本T檢驗比較兩組細胞腫瘤球直徑存在顯著性差異(t=13.929，P=0.000);
　　 第三章 RT

16、-PCR和Western blot分別檢測NC/SW-620和si-TIMP1/SW-620細胞MT1-MMP的表達水平，結(jié)果顯示si-TIMP1/SW-620細胞較NC/SW-620細胞明顯低表達MT1-MMP。Western blot檢測NC/SW-620和si-TIMP1/SW-620細胞上皮標記物E-cadherin和間充質(zhì)標記物Vimentin，結(jié)果顯示si-TIMP1/SW-620細胞較NC/SW-620細胞可提高E-cad

17、herin表達，降低Vimentin表達。Western blot檢測NC/SW-620和si-TIMP1/SW-620細胞EMT標記物ZEB1、ZEB2和SANI1，結(jié)果顯示si-TIMP1/SW-620細胞較NC/SW-620細胞ZEB1，ZEB2和SANI1表達降低。
　　 第四章鑒于常規(guī)的miRNA靶基因預測方法，通過Targetscan，miRanda和PicTar4三個miRNA生物信息網(wǎng)站，預測可能調(diào)節(jié)TIMP1的

18、潛在miRNAs，三種預測結(jié)果均顯示miR-618同TIMP13'UTR有結(jié)合位點，miR-618可能通過結(jié)合于TIMP13'UTR調(diào)控TIMP1的表達。經(jīng)Targetscan在線程序分析提示miR-618與TIMP1 mRNA的82至88之間區(qū)域存在互補結(jié)合序列。miR-618轉(zhuǎn)染SW-620細胞，RT-PCR檢測miR-618的表達，結(jié)果顯示miR-618/SW-620細胞較NC/SW-620細胞明顯高表達miR-618。miR-6

19、18轉(zhuǎn)染SW-620細胞，Westernblot和免疫熒光檢測TIMP1表達，結(jié)果顯示相對于對照組，轉(zhuǎn)染miR-618的SW-620細胞明顯低表達TIMP1蛋白，提示miR-618與TIMP1之間存在著調(diào)控關系，miR-618可抑制TIMP1表達。于是我們構(gòu)建了pTIMP1-CDS，將pTIMP1-CDS轉(zhuǎn)染到SW-620和293T細胞并分別加入miR-618模擬物或抑制物處理48小時后，雙熒光報告基因檢測技術檢測細胞總蛋白的熒光素變化

20、，發(fā)現(xiàn)miR-618 mimics作用這兩種細胞后海腎熒光素酶的活性明顯受抑制，僅為對照組的50％左右;而miR-618 inhibitor作用后海腎熒光素酶的活性呈現(xiàn)不同程度的增加。這些結(jié)果表明miR-618通過作用于pTIMP1-CDS片段，影響了海腎熒光素酶的表達。應用原位雜交、免疫組織化學方法和QRT-PCR分別檢測38例結(jié)直腸癌組織中TIMP-1和miR-618表達水平，F(xiàn)isher確切概率法檢驗結(jié)果顯示miR-618+/TI

21、MP-1-同miR-618+/TIMP-1+病例數(shù)量具有統(tǒng)計學差異(P=0.000)。
　　 結(jié)論:
　　 1、結(jié)直腸癌腹膜轉(zhuǎn)移組織中表達上調(diào)大于4倍的基因有24個，其中包括TIMP-1;TIMP-1蛋白在結(jié)直腸癌組織中表達亦明顯上調(diào)，其表達水平與腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移、臨床分期密切相關，并與患者生存預后存在關聯(lián)，預示其可能成為判斷結(jié)直腸癌進展和預后的理想標志物;
　　 2、沉默TIMP1的表達可顯著抑制SW-620

22、結(jié)腸癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲和腫瘤球形成能力，提高SW-620結(jié)腸癌細胞對5-FU的敏感性;進一步分子生物學實驗發(fā)現(xiàn)，干擾TIMP1的表達可抑制SW-620細胞MT1-MMP蛋白、間充質(zhì)標記物Vimentin及EMT標記物ZEB1、ZEB2和SANI1的表達，促進上皮標記物E-cadherin的表達;
　　 3、miR-618可靶向作用于TIMP13'UTR調(diào)控TIMP1蛋白的表達;此外在結(jié)腸癌標本中，miR-618+/TIMP