葉酸缺乏與基因甲基化在潰瘍性結腸炎發(fā)病機制中的作用研究.pdf

1、目的:
　　潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種特發(fā)性腸道慢性炎癥性疾病，其發(fā)病機制目前尚未完全明確。現認為是遺傳、感染、環(huán)境和免疫因素等多種因素相互作用的結果。有研究發(fā)現促炎因子干擾素γ在UC發(fā)病中發(fā)揮關鍵作用，在UC結腸黏膜中其表達水平明顯增多，而且干擾素基因啟動子區(qū)存在低甲基化改變，其高表達很可能是基因低甲基化的結果。另外有研究表明，在UC小鼠模型中，給予甲基供體(葉酸、維生素B12)缺乏食物可促

2、使某些細胞炎癥因子及化學因子的表達增多，進一步加重結腸黏膜炎癥程度。本研究通過給予UC小鼠模型葉酸缺乏食物，并檢測血清葉酸，結腸黏膜干擾素γ的表達水平及干擾素基因甲基化水平，分析葉酸缺乏是否通過導致基因低甲基化，使干擾素γ高表達而在UC發(fā)病機制中發(fā)揮作用，為UC的診斷及治療提供新的依據。
　　材料和方法:
　　1動物模型的建立及分組:選取符合實驗要求的雌性BALB/C小鼠24只，并隨機分為4組，每組6只，分組如下:A組葉酸缺

3、乏(D)，造模(DSS+);B組標準飲食(C)，造模(DSS+);C組標準飲食(C)，未造模(DSS-);D組葉酸缺乏(D)，未造模(DSS-)。D:予以無葉酸飲食飼養(yǎng);C:給予等量標準飲食，飲水量不限;DSS+:自第6周起，給予5％葡聚糖硫酸鈉溶液作為飲用水，持續(xù)7天，擬建立急性結腸炎小鼠模型:DSS-:僅飲用純凈水，作為對照。
　　2一般狀況觀察:分別于實驗開始前，第5、6周末記錄小鼠體重變化;每日觀察小鼠飲食、飲水量，活動狀

4、態(tài)等生命體征情況;自第6周起至實驗結束，每日觀察并記錄小鼠糞便性狀、肛周紅腫、糜爛及便血程度。實驗結束后，分別采集4組小鼠尾靜脈血及新鮮結腸黏膜組織標本。
　　3結腸炎癥活動度評價:根據小鼠體重減輕程度、糞便性狀、便血程度計分，“正?！庇嫗?分，其余根據程度不同分別計為1、2、3、4分，記錄總分數，依據“結腸炎癥活動指數”=總分數/3(0-4)，評估結腸炎癥活動度;0為健康，4表示炎癥活動程度最大。
　　4血清葉酸檢測:采用

5、生物素雙抗體夾心酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測小鼠外周靜脈血清葉酸水平。
　　5干擾素γ的表達:利用免疫組織化學染色法檢測小鼠結腸黏膜組織干擾素γ的表達。
　　6干擾素基因甲基化:應用生物信息學技術進行干擾素基因啟動子區(qū)CpG島預測并設計甲基化特異性PCR引物。提取結腸組織DNA，應用MSP檢測干擾素基因啟動子區(qū)CpG島甲基化水平。
　　結果:
　　1外周靜脈血清葉酸水平
　　分別檢測四組小鼠血清葉酸濃度

6、，單位為ng/ml，A組濃度值范圍在2.5～3.0，平均值為2.75;B組范圍在13.2～14.1，平均值為13.6;C組范圍在12.5～14.5，平均值為13.5，;D組范圍在2.4～3.1，平均值為2.8。A組和D組的血清葉酸水平較B組和C組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);B組與C組之間，A組與D組之間相比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，P值分別為0.62和0.25。
　　2結腸黏膜組織干擾素γ表達水平

7、>　　A組和B組結腸黏膜組織干擾素γ表達水平較C組和D組均明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);A組較B組明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);C組與D組之間相比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　3干擾素γ表達水平與結腸炎癥活動性指數的相關性分析
　　A組和B組中，干擾素γ表達水平與結腸炎癥活動性指數呈正相關，相關系數r為0.796(P＜0.01)。
　　4葉酸水平分別與干擾素γ表達水平、結腸炎癥

8、活動性指數的相關性分析
　　A組中，葉酸水平分別與干擾素γ表達水平、結腸炎癥活動性指數呈負相關，相關系數r分別為-0.880、-0.997(P＜0.05);B組中，葉酸水平與干擾素γ的表達、結腸炎癥活動性指數不具有相關性(P＞0.05);C組中，葉酸水平與干擾素γ表達水平無相關性(P＞0.05);D組中，葉酸水平與干擾素γ水平呈負相關，相關系數r為-0.867(P＜0.05)。
　　5各組小鼠結腸黏膜組織干擾素基因MSP檢測

9、，未出現基因啟動子區(qū)CpG島甲基化
　　MSP產物經2.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測IFNG的甲基化改變，A、B、C、D四組樣本分別用甲基化特異性引物擴增，其產物經檢測未出現甲基化條帶;四組樣本用非甲基化特異性引物擴增，其產物經檢測出現非甲基化條帶，基因擴增產物的大小約70bp(50bp～100bp);空白對照未出現擴增條帶。
　　結論:
　　1在急性潰瘍性結腸炎小鼠模型中，葉酸的缺乏可導致炎癥因子干擾素γ的表達增高，加重結