激活WNT-β-Catenin信號通路促進梗阻性黃疸大鼠肝再生的作用機制研究.pdf

1、背景：
　　在肝膽胰外科領域，梗阻性黃疸(Obstructive jaundice，OJ)是患者就診最常見的原因之一。伴有淤膽的肝臟疾病，如肝門部膽管癌、膽管囊狀擴張癥、膽石癥等需要行肝臟部分切除術進行治療。然而伴有黃疸的肝臟行大范圍肝切除時術后并發(fā)癥高，并存在肝功能衰竭的風險，這已成為肝膽外科亟待解決的重要基礎性問題。既往研究表明這與殘肝功能體積不足和再生能力下降有關。雖然目前對正常肝臟再生的機制有了一定了解，但是黃疸狀態(tài)下影響

2、肝再生的機制仍未闡明，特別是分子機制仍然模糊。臨床上處理方法主要是術前的引流，術中的損傷控制手術以及術后的護肝治療，雖然取得了一定療效，但仍然是一種被動性的治療，還存在一定的局限性，例如長時間的引流貽誤了手術時機，內引流引起膽道感染和胰腺炎發(fā)作，一些膽管不擴張的淤膽和輕中度的黃疸水平如何制定肝切除手術規(guī)劃等等。上述這些方法均未從根本機制上改善黃疸對肝再生的影響。因此研究黃疸狀態(tài)下肝再生的分子機制，對于改變目前這種被動的“期待”治療，完善

3、伴有黃疸的肝切除術的治療體系有重要的臨床意義。
　　隨著組學研究和生物信息學的發(fā)展，文獻已報道通過基因芯片技術篩選得到與肝再生相關的若干信號通號，為了了解這些通路是否在OJ狀態(tài)下也參與肝再生的過程，我們經過預實驗篩選出在OJ大鼠肝切除術后肝再生過程中同樣發(fā)揮重要作用的Wnt/β-Catenin信號通路進行研究。既往在正常大鼠70％肝切除模型中已經證明，Wnt/β-Catenin信號通路在肝再生過程中發(fā)揮著重要作用，但在OJ狀態(tài)下，

4、Wnt/β-Catenin信號通路在肝再生過程中如何發(fā)揮作用，肝再生受到抑制是否與Wnt/β-Catenin信號通路有關這些問題尚未明確，相關研究未見報道。因此本文在建立改良的大鼠OJ后肝切除+內引流的模型基礎上，觀察OJ對肝再生的影響和變化規(guī)律，研究Wnt/β-Catenin信號通路在黃疸條件下對肝再生的作用，探索黃疸對肝再生的影響的分子機制。
　　第一部分結合顯微外科技術改良大鼠梗阻性黃疸后肝切除+內引流模型
　　目的:

5、為了更好地研究黃疸的病理生理機制，既往已經建立了多種大鼠梗阻性黃疸后肝切除+內引流模型，但膽管堵塞、膽道感染等并發(fā)癥仍常見，術后死亡率高，影響了模型的穩(wěn)定性。本研究利用顯微外科技術，建立改良的大鼠OJ后肝切除+內引流模型，評估改良模型的穩(wěn)定性和安全性，為研究OJ對肝臟再生的影響提供穩(wěn)定的模型保證。
　　方法:在建立大鼠OJ的基礎上，改良了肝切除術后內引流的方法，將傳統(tǒng)的擴張近端膽管與十二指腸內引流改良為近端擴張膽管與遠端胰腺段膽管

6、內支架引流的方法。所有的操作均在顯微鏡下完成。改良的具體方法如下:第一次手術結扎并切斷膽總管，建立梗阻性黃疸模型。7天后進行第二次手術，用特制引流管將胰腺段膽總管與擴張近端膽總管連接建立膽管—膽管內引流，然后行70％肝切除。實驗采用健康成年雄性SD大鼠，體重240-280g。根據手術方法不同將大鼠隨機分為4組。Group1(G1):為假手術組，開腹后，游離膽總管但不做任何處理后關腹;Group2(G2):建立OJ7天后，行傳統(tǒng)的近端擴張

7、膽道—十二指腸內引流+70％肝切除;Group3(G3):非顯微鏡下建立OJ，7天后采用改良的擴張近端膽道—膽道內引流+70％肝切除模型，全程均不使用顯微鏡;Group(G4):全顯微鏡下建立OJ，7天后采用改良的膽道—膽道內引流+70％肝切除模型。觀察術后手術并發(fā)癥和死亡率，采用Kaplan-Meier法進行生存分析，在術后1h、6h、12h、1d、3d、7d、10d、14d時間乙醚麻醉下處死大鼠抽血并取材，比較各組生化指標、肝臟病理

8、改變，評估新型模型的穩(wěn)定性和安全性。
　　結果:三種OJ建模方法成功率分別為G286.3％，G388.8％，G497.5％(P＜0.05)，膽瘺和漏扎尾狀葉膽管是造模失敗的主要原因。OJ7天后行內引流+肝切除，G2、G3、G4三組早期肝臟功能快速恢復，7天后G4組肝功能最為穩(wěn)定。術后兩周并發(fā)癥分別是G220％，G311.8％，G46.25％(P＜0.05)，三組的生存率分別為G260.0％，G368.8％，G492.0％(P＜0.

9、05)。術后早期G3組與G4組淀粉酶一過性升高，G3組與G2組比較差異有顯著性(P＜0.05)，G4組與G2組比較差異無顯著性（P＞0.05）。
　　結論:結合顯微外科技術，改良的大鼠OJ后肝切除+內引流模型手術創(chuàng)傷小，術后并發(fā)癥低，術后生存率高，模型的穩(wěn)定性和安全性優(yōu)于傳統(tǒng)方法，是膽道內引流相關實驗研究的理想模型。
　　第二部分梗阻性黃疸對大鼠肝再生的影響及與Wnt/β-catenin信號通路的關系
　　目的:建立大

10、鼠OJ后肝切除+內引流的肝臟再生模型，觀察OJ后對肝再生的影響和變化規(guī)律，研究與肝臟再生相關的Wnt/β-Catenin信號通路在黃疸條件下對肝再生的作用，為探索黃疸對肝再生影響的分子機制提供依據。
　　方法:動物隨機分為三組，分別為假手組、對照組（非梗黃70％肝切除）和實驗組（梗黃后70％切除）。每組分六個觀察時間點，分別為術后1h、6h、12h、24h、72h和168。觀察比較三組之間血清生化指標變化、肝重體重比、肝臟再生率，

11、免疫組織化學法計算肝臟Ki-67和PCNA標記指數。Western blot法檢測肝組織中Wnt/β-Catenin通路相關蛋白表達;qRT-PCR法檢測Wnt/β-Catenin通路相關基因在肝臟的表達。
　　結果:實驗組和對照組術后均全部存活，實驗組ALT和AST在術后1h、6h、12h和24h均高于對照組(P＜0.05);實驗組Alb在術后24h、72h和168h均低于對照組(P＜0.05);實驗組的肝體重比和肝再生率在72

12、h和168h均低于對照組(P＜0.05);實驗組的Ki-67標記指數和PCNA標記指數在12h、24h和72h均低于對照組(P＜0.05);western blot分析β-catenin在對照組6h表達量開始增加，在術后24h-72h達高峰，而在實驗組β-catenin的表達在術后12h才開始增加，較對照組延遲，但無明顯的表達高峰。對照組中cyclin D1和cyclin E1蛋白在術后12h開始高表達，持續(xù)至術后72h，而實驗組中蛋白

13、表達24h開始，表達高峰較對照組延遲;qRT-PCR分析對照組中cyclin D1和cyclin E1在術后6h表達量開始升高，在24h和72h達到高峰，而實驗組mRNA表達在術后24h開始升高。實驗組cyclin D1和cyclin E1的基因表達在12h、24h和72h均低于對照組(P＜0.05)。
　　結論:梗阻性黃疸行肝切除后肝臟再生受到明顯抑制，表現為肝再生延遲，與Wnt/β-Catenin信號通路受抑制，β-Caten

14、in表達受抑制有關。
　　第三部分Wnt激動劑對梗阻性黃疸大鼠肝切除術后肝臟的保護性作用及機制
　　目的:我們在第二部分研究中發(fā)現，OJ使大鼠肝切除后肝再生延遲，與Wnt/β-catenin信號通路受抑制，β-catenin低表達有關。因此在本部分研究我們在OJ大鼠肝切除術前通過外源性藥物激活Wnt/β-catenin通路，觀察肝切除術后肝再生變化，并探討其分子機制。
　　方法:雄性SD大鼠被隨機分為3組。Group1

15、(G1):為假手術組，大鼠只進行開腹和關腹處理;Group2(G2):為對照組，OJ7天后行內引流+70％肝切除前，腹腔注射0.9％生理鹽水;Group3(G3):為治療組，大鼠在梗阻性黃疸7天后行內引流和70％肝切除，肝切除前腹腔注射 Wnt激動劑[(2-amino-4-[3,4-(methylenedioxy)benzylamino]-6-(3-methoxyphenyl)pyrimidine)],5mg/kg。大鼠在術后1h，6h

16、，12h，24h，72h和168h6個時間點取材。觀察比較三組之間術后肝損傷、肝臟再生變化，Wnt/β-catenin信號通路相關基因和蛋白表達變化。
　　結果:實驗組術后的肝功能和肝臟的再生相關指數均好于對照組，實驗組ALT和AST在術后6h、12h和24h均低于對照組(P＜0.05);實驗組TBIL在術后12h和24h均低于對照組(P＜0.05);實驗組Alb在術后72h和168h均高于對照組(P＜0.05);實驗組的肝體重比

17、和肝再生率在72h和168h均高于對照組(P＜0.05);實驗組的Ki-67標記指數和PCNA標記指數在24h和72h均高于對照組(P＜0.05);western blot分析β-catenin在實驗組6h開始表達量開始增加，在術后24-72h達高峰，而在對照組β-catenin的表達在術后12h才開始增加，較實驗組延遲，但無明顯的表達高峰。實驗組中cyclin D1和cyclin E1蛋白在術后12h開始高表達，持續(xù)至術后72h，而對

18、照組中蛋白表達24h開始，表達高峰較對照組延遲;qRT-PCR分析實驗組中cyclinD1和cyclinE1在術后6h表達量開始升高，在24h和72h達到高峰，而對照組cyclin D1和cyclin E1在術后24h表達量開始升高，實驗組基因表達在12h、24h和72h均高于對照組(P＜0.05)。
　　結論:梗阻性黃疸大鼠肝切除術后肝再生延遲啟動與wnt/β-catenin信號通路受抑制有關，通過激活wnt/β-catenin