低氧誘導因子-1負調(diào)控Cyclin D1的分子機制及其在腫瘤化療抵抗中的作用研究.pdf

1、第一部分 HIF-1負調(diào)控cyclinD1的分子機制及其在肺癌化療抵抗中的作用研究 研究背景和目的: 哺乳動物細胞可以通過改變代謝狀態(tài)和生長速度來適應環(huán)境中氧濃度的變化，其中最常見反應就是生長抑制。低氧可以引起多種細胞的周期阻滯，但具體機制仍未闡明，近年來研究發(fā)現(xiàn)低氧誘導因子(Hypoxia-InducibleFactor-1，HIF-1)是介導這一過程的重要分子。HIF-1以異源二聚體的形式存在，由α亞單位(H

2、IF-1α)和β亞單位(HIF-1β)組成。常氧條件下，HIF-1α極易被降解，其降解途徑是泛素-蛋白水解酶復合體；低氧條件下，HIF-1α降解過程被阻斷，導致HIF-1α積累，并與HIF-1β結合形成活性形式，影響多種靶基因表達，參與調(diào)節(jié)血管形成、鐵代謝、葡萄糖代謝、細胞增殖和存活等生理過程。HIF-1靶基因結構上都包含有低氧反應元件(HypoxiaResponseElement，HRE)，HRE是指被調(diào)控基因的啟動子或增強子中包含一

3、段特定的核苷酸序列，其核心序列為5’-RCGTG-3’?；罨腍IF-1與其結合位點結合后，在靶基因的轉錄起始部位形成一個轉錄起始復合物，從而調(diào)節(jié)靶基因的轉錄。 細胞周期是一種非常復雜的過程并受到精細的調(diào)節(jié)，有大量調(diào)節(jié)蛋白參與其中。此過程的核心是細胞周期依賴性蛋白激酶(CyclinDependentKinases，CDKs)，CDK的激活又依賴于另一類呈細胞周期特異性或時相性表達的細胞周期蛋白(cyclins)，其中cyclin

4、D1就是一種非常重要的周期蛋白。CyclinD1基因屬于細胞周期素家族中的一員，基因定位于染色體11q13，編碼由295個氨基酸組成的蛋白質。CyclinD1可與細胞周期索依賴激酶CDK4組成CyclinD1/CDK4復合物，使Rb磷酸化，從而釋放出轉錄因子E2F，促進細胞周期由G1期到S期的轉變。機體中的細胞時常受到低氧的刺激，而在腫瘤細胞特別是實體瘤中，缺氧更是普遍存在的現(xiàn)象。低氧條件下，細胞中產(chǎn)生的HIF-1調(diào)節(jié)靶基因轉錄，引起一

5、系列細胞對缺氧的反應，具有重要的病理生理學意義。腫瘤組織的缺氧被認為與腫瘤對放療、化療耐受及惡性進展、遠處轉移密切相關。近年來發(fā)現(xiàn)HIF-1是腫瘤治療中重要的靶點分子，可能參與了實體腫瘤對化療藥物的耐藥機制。我們預實驗的結果發(fā)現(xiàn)HIF-1對cyclinD1存在負調(diào)控作用，而且通過序列分析，在cyclinD1的啟動區(qū)中發(fā)現(xiàn)了HIF-1結合位點，本研究旨在闡明HIF-1對cyclinD1的調(diào)控機制，觀察這種調(diào)控作用對腫瘤細胞生長和化療敏感性

6、的影響，加深我們對腫瘤生物學的認識，為研發(fā)新的腫瘤治療藥物和方法提供理論依據(jù)。 實驗方法： 一、利用外源刺激物或低氧處理，觀察HIF-1對cyclinD1的負調(diào)控作用 1．外源刺激物誘導或低氧處理使HIF-1活化后，利用報告基因、RT-PCR和western-blot檢測正常細胞和腫瘤細胞中cyclinD1表達的變化； 2．應用HIF-1基因敲除細胞驗證在正常細胞中HIF-1對cyclinD1的調(diào)控作用；

7、 3．探明在生理條件下，腫瘤細胞中過度表達HIF-1對cyclinD1的影響； 4．利用HIF-1的顯性負性突變體(DN-HIF)抑制HIF-1活化，對上述的結果進行驗證。 二、HIF-1對腫瘤生長的影響 1．建立穩(wěn)定表達DN-HIF的A549和Beas-2B細胞系； 2．利用流式細胞分析和CCK-8生長曲線測定方法，觀察抑制HIF-1活性對腫瘤細胞的細胞周期和增殖的影響； 3．將上述腫瘤

8、細胞接種實驗動物后，觀察腫瘤的生長情況； 4．利用免疫組化方法驗證荷瘤鼠腫瘤中HIF-1與cyclinD1表達的關系。 三、HIF-1對cyclinD1調(diào)控作用的分子機制 1．構建啟動區(qū)中HRE突變的cyclinD1報告基因質粒，分析HIF-1對cyclinD1的調(diào)控是否為直接作用； 2．進行ChIP實驗，進一步明確HIF-1與cyclinD1promoter間的直接相互作用； 3．構建HDAC的

9、RNA干擾質粒，并利用HDAC抑制劑TSA，分析HDAC在HIF-1負調(diào)控cyclinD1機制中的作用。 四、HIF-1在肺癌細胞化療敏感性中的作用 1．利用TUNNEL方法和流式細胞儀檢測，觀察HIF-1在周期特異性化療藥物5-FU誘導的肺癌細胞凋亡中的作用； 2．研究HIF-1對cyclinD1的調(diào)控作用對腫瘤細胞化療敏感性的影響。 結論： 1．在正常肺上皮細胞和腫瘤細胞中，常氧條件和低氧條件

10、下，低氧誘導因子-1(hypoxiainduciblefactor-1，HIF-1)均能夠負調(diào)控周期素D1(cyclinD1)； 2．HIF-1可以直接與cyclinD1啟動區(qū)中的HRE相互作用，起到負調(diào)控的作用，該調(diào)控作用需要組蛋白去乙?；?7(HDAC7)的參與，TSA處理和干擾HDAC7均能抑制這種負調(diào)控； 3．HIF-1負調(diào)控cyclinD1能夠引起肺癌細胞A549周期阻滯，抑制細胞的增殖，在荷瘤小鼠體內(nèi)也能觀

11、察到HIF-1與cyclinD1的負相關，這可能是腫瘤細胞逃避放、化療的機制之一； 4．A549細胞中外源表達DN-HIF能夠顯著增加細胞周期特異性化療藥物5-FIJ引起的細胞凋亡，而干擾cyclinD1后5-FU引起的細胞凋亡被明顯抑制。這為我們理解腫瘤化療抵抗的機制和開發(fā)新的治療藥物提供了新的思路。 第二部分 CyclinG1誘導上皮間質轉化促進肝癌轉移 肝癌復發(fā)轉移是一個十分復雜的問題，國內(nèi)外研究發(fā)

12、現(xiàn)不少的癌基因、生長因子等與肝癌侵襲性相關，多種細胞外基質成分也有重要作用，而且可能與原發(fā)瘤的基因特性有關。但是肝癌復發(fā)轉移的機制仍然沒有完全闡明，下一步的重點將是如何早期預測肝癌的復發(fā)轉移，并盡早施行針對性的抗轉移復發(fā)治療。 由于傳統(tǒng)的臨床預后指標有其自身的局限性，尚不能完全反映肝癌的生物學特性。為了進一步指導肝癌的診斷、治療和預后的判斷，尋找其它有效的分子生物學指標一直以來都是肝癌研究的熱點。 細胞周期蛋白G是cyc

13、lins家族成員之一，目前發(fā)現(xiàn)cyclinG主要有2種亞型cyclinG1和cyclinG2℃yclinG1與其他的周期蛋白不同，其N端有一典型的細胞周期蛋白盒，但沒有降解盒或PEST序列，也沒有找到相應的細胞周期蛋白依賴性激酶，其生物學功能尚未完全闡明，有證據(jù)表明cyclinG1可能參與DNA損傷修復、細胞周期調(diào)控、凋亡等細胞生物學過程，近來研究發(fā)現(xiàn)cyclinG1與腫瘤的關系密切，在多種腫瘤中都存在著異常表達，可能對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起

14、到了促進作用。 實驗方法： 1．利用RT-PCR、western-blot和免疫組織化學方法檢測肝癌細胞系或者肝癌臨床組織樣品中cyclinG1的表達情況； 2．利用慢病毒系統(tǒng)建立cyclinG1穩(wěn)定高表達的細胞株L02/cyclinG1、SMMC-7721/cyclinG1和HepG2/cyclinG1及其相應的對照細胞株； 3．侵襲浸潤實驗：比較SMMC-7721/cyclinG1和：HepG2/cy

15、clinG1與其對照組SMMC-7721/GFP和HepG2/GFP在侵襲浸潤特性上的差異； 4．劃痕損傷實驗：比較SMMC-7721/cyclinG1和HepG2/cyclinG1與其對照組SMMC-7721/GFP和．HepG2/GFP在遷移動力學功能上的差異： 5．生長曲線：比較L02/cyclinG1、SMMC-7721/cyclinG1和HepG2/cyclinG1及其對照細胞系在分裂增殖上的差異： 6

16、．動物試驗：比較SMMC-7721/cyclinG1細胞系與其對照細胞在裸鼠體內(nèi)成瘤和轉移特性的差異； 7．形態(tài)學觀察，免疫組織化學等方法評價cyclinG1對肝癌細胞株上皮間質轉化(EMT)的影響，并檢測EMT相關特征分子和干細胞標志物的表達變化。 利用流式細胞和經(jīng)典信號通路的研究方法，初步探討cyclinG1影響肝癌轉移特性的分子機制。 結論： 1．CyclinG1在肝癌細胞系和臨床組織樣品中普遍呈現(xiàn)

17、中高表達，提示其與肝癌發(fā)生發(fā)展有密切的相關性； 2．CyclinG1在肝癌中不僅與肝癌發(fā)生相關，還可能作為一種腫瘤進展基因起作用，可以影響肝癌細胞的侵襲轉移特性，從而提高肝癌的惡性程度； 3．CyclinG1可能通過作用于PI3K/AKT信號通路對EMT的相關分子進行調(diào)控，促進上皮間質轉化，甚至獲得干細胞潛能，最終影響肝癌細胞的浸潤轉移能力； 4．CyclinG1有可能成為判斷肝癌患者進展及預后的一個新分子標志物