葡萄糖氧化酶構(gòu)象鎖及直接電化學(xué)研究.pdf

1、TheKinetic，C0nformationalandElectrochemicalStudiesonGlucoseoxidaseADissertationSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanUIliVers時(shí)i11P叭ialFulfilhllentoftheRequ打ementsfortheDe伊eeofMasterofScienceBy阮咖fG口DSupeIVisor：PIofHongJunDat

2、e：Jun，20l4摘要本文對(duì)葡萄糖氧化酶(GOD)活性測(cè)定的新方法進(jìn)行了探究，并且從酶的熱失活角度運(yùn)用構(gòu)象鎖原理，對(duì)葡萄糖氧化酶的熱失活過(guò)程及構(gòu)象鎖進(jìn)行了分析，從而進(jìn)一步了解葡萄糖氧化酶的特性，對(duì)其應(yīng)用具有重要的指導(dǎo)意義；采用新型納米材料羥基化富勒烯對(duì)葡萄糖氧化酶的電化學(xué)進(jìn)行了研究，實(shí)現(xiàn)了葡萄糖氧化酶在玻碳電極上的直接電化學(xué)，為其新型生物傳感器的研究提供了理論基礎(chǔ)。在葡萄糖氧化酶一辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)體系的基礎(chǔ)上，使用愈創(chuàng)木酚，與分光光

3、度法相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)葡萄糖氧化酶活性簡(jiǎn)單，快捷，靈敏測(cè)定。研究表明，使用愈創(chuàng)木酚對(duì)葡萄糖氧化酶活性進(jìn)行測(cè)定最佳pH為58，并沒(méi)有使最適pH發(fā)生改變，符合葡萄糖氧化酶的最適pH，有利于準(zhǔn)確的測(cè)定葡萄糖氧化酶的活性；利用愈創(chuàng)木酚測(cè)定sigma公司提供葡萄糖氧化酶的活性酶活兒423u／mg，與sigma公司提供酶活數(shù)據(jù)≥100U／mg一致，證明該測(cè)定葡萄糖氧化酶酶活新方法具有良好的準(zhǔn)確性；此外新方法測(cè)定酶活穩(wěn)定可靠，對(duì)多次重復(fù)測(cè)定酶的數(shù)據(jù)分析，

4、酶活數(shù)據(jù)之間的標(biāo)準(zhǔn)差RSD=28％，具有很好的重復(fù)性。采用愈創(chuàng)木酚測(cè)定葡萄糖氧化酶活性的新方法，對(duì)葡萄糖氧化酶的熱失活過(guò)程和構(gòu)象鎖進(jìn)行研究。葡萄糖氧化酶是同型二聚體寡聚蛋白酶，研究表明，葡萄糖氧化酶熱失活過(guò)程分為兩個(gè)直線(xiàn)階段和一個(gè)拐點(diǎn)(熱致失活溫度，T。。。)，數(shù)據(jù)表明葡萄糖氧化酶的Topt為55℃，當(dāng)葡萄糖氧化酶在小于55℃時(shí)，其活性變化不大，比較穩(wěn)定，當(dāng)其所處環(huán)境溫度大于55℃時(shí)，將導(dǎo)致其快速失活。根據(jù)構(gòu)象鎖理論，在葡萄糖氧化酶快速

5、失活的過(guò)程中，存在著酶失活的潛伏期，即在這一過(guò)程中，葡萄糖氧化酶以不同活性大小的中間體形式存在，當(dāng)達(dá)到一定時(shí)間時(shí)，葡萄糖氧化酶二聚體解離成單體，以致其全部失活，根據(jù)構(gòu)象鎖理論，研究得知，葡萄糖氧化酶的構(gòu)象鎖數(shù)為2。富勒烯被發(fā)現(xiàn)以來(lái)備受關(guān)注，但是其水溶性較差，不便于研究，然而富勒烯的衍生物一羥基化富勒烯(肝s)水溶性較好，另外由于羥基化富勒烯具有超強(qiáng)的導(dǎo)電性，因此可將其應(yīng)用到酶的電化學(xué)研究當(dāng)中，本實(shí)驗(yàn)采用羥基化富勒烯修飾電極來(lái)研究葡萄糖氧