抗幽門螺桿菌UreB及HpaA抗原單抗的制備及臨床應用探索.pdf

1、目的：幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，Hp)是一種定植于胃內的革蘭氏染色陰性、螺桿狀、微需氧菌，目前全球近50％的人口感染了Hp，在發(fā)展中國家，其感染率可達到70％以上。因此，建立無創(chuàng)、便捷、廉價的檢測方法對Hp的早期診斷具有重要的應用價值。目前，Hp的診斷方法主要有侵入性和非侵入性，非侵入性因為良好的病人依從性而倍受青睞。而非侵入性方法中，血清學實驗在年輕患者中準確性不高，而13C尿素呼吸實驗很昂貴，因而有必要尋找一

2、種準確性高、無創(chuàng)、簡便、價廉的診斷Hp感染的新方法。由于Hp是經糞-口傳播，因此，以ELISA方法檢測糞便中Hp抗原(HpyloristoolantigenEIA，HpSA)就成為可能。自從1998年HpSA檢測被FDA批準在臨床應用后該方法就在世界各國被評價，平均敏感性和特異性可達到90-98％，HpSA檢測是一種廉價、實用的方法，不僅適用于治療前和治療后的診斷，而且對于各年齡段的兒童準確性均很高。 Hp尿素酶B亞單位(ure

3、aseBunit,UreB)和Hp粘附素A亞單位(HelicobacterpyloriadhesinAunit,HpaA)均是位于Hp菌體表面的蛋白，在Hp各菌株中甚至球形體中都保守存在，其中UreB含量較高，占菌體總蛋白2.5-5％，而HpaA蛋白特異性較好，本研究擬通過制備抗Hp尿素酶B亞單位蛋白和鞭毛粘附素蛋白A蛋白的單克隆抗體，對抗體特性進行鑒定，建立夾心ELISA檢測體系，對人糞便樣本進行檢測，為Hp臨床診斷奠定基礎。

4、 方法： 1.抗UreB和抗HpaA單克隆抗體的制備采用雜交瘤技術制備抗UreB和HpaA單克隆抗體，對比硫酸銨沉淀法、辛酸-硫酸銨法、蛋白A柱親和層析法三種純化方法對單抗親和力的影響，從而確定最佳純化方案。 2.抗UreB和抗HpaA單克隆抗體特性的鑒定以非競爭ELISA法測定單抗的親和常數；以ELISA相加實驗初步確定單抗識別的表位；以間接熒光法分析單抗與Hp表面蛋白結合特性，以Westernblot鑒定單抗與重組蛋

5、白、Hp標準菌株、Hp臨床分離株、Hp球形體的反應性，與腸致病性大腸桿菌、普通變形桿菌、綠膿桿菌、克雷白氏產氣桿菌等腸道常見菌的特異性。 3.夾心ELISA法的建立制備兔抗Hp多克隆抗體，建立(1)抗HpaA單抗包被、多抗夾心(2)抗UreB單抗包被、多抗夾心(3)抗UreB和HpaA單抗以10μg/ml，5μg/ml混合包被、多抗夾心等三種檢測系統(tǒng)，摸索了最適單抗包被量，最適夾心抗體量，最適封閉液及封閉時間，鑒定ELISA系統(tǒng)

6、對Hp標準菌株及四種腸道常見菌的反應特異性，測定各ELISA系統(tǒng)的最低檢出限。 4.糞便樣本的檢測對經13C確診的10份正常人糞便標本和6份Hp陽性患者糞便樣本進行檢測，以陰性標本的cut-off值為陽性判斷標準。 結果： 1.制備了3株抗HpaA單抗，HpaA-2C6、HpaA-A2、HpaA-2B3；4株抗UreB單抗，UreB-6E6、UreB-1D6、UreB-1D5、UreB-9E1。對比三種抗體純化方

7、法的優(yōu)劣，結果表明，硫酸銨沉淀法、辛酸-硫酸銨法、蛋白A柱親和層析法UVP掃描抗體純度分別為80％、94％、97％，但硫酸銨沉淀法、辛酸-硫酸銨法純化得到的抗體相對親和力高于蛋白A柱親和層析法，因此選擇辛酸-硫酸銨法作為抗體純化方法。 2.間接免疫熒光法直接證明6E6和2C6能與Hp表面蛋白結合，westernblot證明7株單抗均與重組蛋白、Hp標準菌株、Hp臨床分離株、Hp球形體發(fā)生特異性反應，與腸致病性大腸桿菌、普通變形桿

8、菌、綠膿桿菌、克雷白氏產氣桿菌無交叉反應。7株單抗的親和常數在107-109之間，其中單抗HpaA-2C6和UreB-6E6親和常數為4.660×108，3.036×109，由于具有相對高的親和力做為ELISA檢測系統(tǒng)的候選抗體。 3.ELISA檢測系統(tǒng)的最適封閉液和封閉條件為10％FCS，37℃孵育2小時，而后4℃過夜。HpaA系統(tǒng)和UreB系統(tǒng)均能與Hp全菌發(fā)生特異性反應，與其它四種腸道常見菌無特異性反應。HpaA系統(tǒng)最低檢

9、出限為10.3μg/ml，UreB系統(tǒng)的最低檢出限為0.35μg/ml，HpaA和UreB單抗以5μg/ml、10μg/ml包被系統(tǒng)的最低檢出限為0.18μg/ml。 4.三種ELISA檢測系統(tǒng)中，UreB組的cut-off值為0.166，HpaA組的cut-off值為0.376，UreB和HpaA混合組的cut-off值為0.176。10例陰性樣本和6例陽性樣本中，UreB組和混合組有無假陰性、假陽性結果。而HpaA組出現三例

10、假陰性，無假陽性結果。 結論： 1.通過雜交瘤技術成功制備了抗UreB和抗HpaA單抗，確定了純化單抗的最佳方案。 2.對7株單抗的特性進行了鑒定，發(fā)現均具有較高的特異性，單抗HpaA-2C6和UreB-6E6由于具有較高親和常數而作為ELISA檢測系統(tǒng)的候選抗體。這些抗體在基因重組蛋白的純化、Hp致病機理的基礎性研究以及鼠源性抗體治療研究等方面可能具有重要的應用價值。 3.初步建立了三種ELISA檢測系