TREM2調控小膠質細胞功能活化狀態(tài)參與腦保護作用機制的研究.pdf

1、心腦血管疾病一直是危害人類健康的“頭號殺手”，而中國作為人口老齡化大國，缺血性腦中風的發(fā)病率居高不下，嚴重影響國民健康。自1994年，缺血性腦中風已成為中國大城市中第一位致死性疾病，每10萬人口中約有429～620人患此病，每年每10萬人口中約有116～142例死亡。腦對缺血缺氧等刺激非常敏感且耐受能力最差，是最容易發(fā)生缺血再灌注損傷的器官之一，其功能障礙對人的精神、情感、行為、意識以及幾乎所有的臟器功能均會產生不同程度的影響。腦缺血損

2、傷后的神經炎癥往往貫穿缺血再灌注損傷病理發(fā)展的全過程，強烈的神經炎癥反應造成的腦繼發(fā)性損傷是目前臨床上非常棘手的問題，因而抑制腦內神經炎癥將會為腦中風患者的治療和預后帶來曙光。小膠質細胞作為腦內免疫細胞的代表，其在神經炎癥中的功能變化受到人們的廣泛關注。在缺血再灌注損傷的不同時期，小膠質細胞的功能持續(xù)發(fā)生變化。經典激活狀態(tài)（M1 phenotype）的小膠質細胞在炎癥早期釋放大量炎癥因子及氧自由基等有害物質，破壞神經元結構的完整性和功能

3、的穩(wěn)定性；而選擇性激活狀態(tài)（M2 phenotype）的小膠質細胞則在炎癥晚期分泌一些神經營養(yǎng)物質，清除壞死或凋亡的神經元碎片，促進組織膠質瘢痕的形成以及營養(yǎng)神經元。因而調控小膠質細胞的功能活化狀態(tài)使其趨利避害，減輕腦內神經炎癥，控制疾病的發(fā)生發(fā)展，將是防治缺血后神經損傷的新目標。II型髓樣細胞激發(fā)受體（TREM2）是高表達于小膠質細胞上的一種免疫球蛋白樣受體，它在自身免疫及炎癥過程中發(fā)揮“負性調節(jié)”的有益作用。那么TREM2是不是調控

4、小膠質細胞活化狀態(tài)轉變的關鍵靶點？調控TREM2的表達能否改善腦缺血損傷后的神經功能？針對這些科學問題，我們通過體內、體外實驗證實了上調TREM2的表達可促使小膠質細胞由M1型向M2型轉變減輕神經炎癥，改善缺血后神經功能，初步闡明TREM2是調控小膠質細胞活化狀態(tài)的重要信號分子，有助于缺血性腦中風新型治療手段和藥物的研發(fā)。
　　實驗一：不同功能活化狀態(tài)的小膠質細胞中TREM2的表達
　　目的：觀察TREM2在M1和M2兩種不

5、同功能活化狀態(tài)小膠質細胞中的表達，初步明確其與M1和M2活化狀態(tài)的關系。
　　方法：采用LPS/IFN-γ定向誘導原代小膠質細胞向M1型轉化，L-4/IL-13定向誘導原代小膠質細胞向M2型轉化，應用Western Blot和免疫熒光染色方法檢測細胞內M1標記物iNOS、M2標記物Arg-1以及TREM2的表達。
　　結果：LPS/IFN-γ組iNOS表達較control組多（P<0.05），而IL-4/IL-13組Arg-

6、1表達較control組多（P<0.05），初步將小膠質細胞按功能狀態(tài)區(qū)分開來，進而發(fā)現(xiàn)TREM2在IL-4/IL-13組表達升高，且與control組相比有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。免疫熒光雙標染色結果與Western Blot近乎一致。
　　結論：TREM2在M2型小膠質細胞上表達升高，而在M1型小膠質細胞上表達降低。
　　實驗二：腦缺血損傷后小膠質細胞功能活化狀態(tài)的變化及TREM2的表達
　　目的：觀察腦缺血后

7、再灌注不同時間點小膠質細胞M1型和M2型標記物的變化及TREM2的表達情況。
　　方法：將27只SPF級雄性C57BL/6小鼠分為Sham組和MCAO組，其中MCAO組小鼠再次隨機分為4組，即構建MCAO動物模型后，于再灌注后的6h，24h，3d和7d分別取缺血半暗帶腦組織（n=6），應用Western Blot和免疫熒光染色方法檢測并觀察梗死同側區(qū)半暗帶腦組織中iNOS、IL-6、Arg-1、BDNF及TREM2的表達。

8、　　結果：再灌注后6h，iNOS的表達最高（P<0.01），同樣在6h這一時間點也觀察到IL-6的表達增加（P<0.001），M1型標記物iNOS、IL-6在6h、24h均較對照組升高，M2型小標記物Arg-1和BDNF于再灌注后7d表達最高（P<0.001）。TREM2的表達隨缺血再灌注時間的延長而逐漸增高，在3d表達最高（P<0.001）。
　　結論：腦缺血損傷后早期以M1型小膠質細胞為主，腦缺血損傷后晚期以M2型小膠質細胞為

9、主，TREM2在缺血再灌注后3d即M1/M2過渡期表達最高。
　　實驗三：下調TREM2的表達對腦缺血損傷的影響
　　目的：探討下調TREM2的表達后對腦梗死容積、神經行為學評分、神經元凋亡的影響。
　　方法：雄性C57BL/6小鼠24只分為以下3組：MCAO組、siRNA組、scrRNA組，其中MCAO組處理方法同前；siRNA組、scrRNA組：側腦室注射TREM2-siRNA、control siRNA，72 h

10、后構建MCAO模型，大腦中動脈缺血1h后再灌注。缺血再灌注后3d取腦組織，通過TTC染色、神經行為學評分（Longa評分）、TUNEL染色的方法對腦功能進行評估。
　　結果：TUNEL染色結果顯示TREM2-siRNA組與MCAO組相比，神經元凋亡數目明顯增多（P<0.05），但TREM2-siRNA組的小鼠腦梗死容積和神經行為學評分與MCAO組無統(tǒng)計學差異。
　　結論：下調TREM2的表達后加重神經元的凋亡。
　　實

11、驗四：上調TREM2的表達發(fā)揮腦保護作用
　　目的：探討上調TREM2的表達后對腦梗死容積、神經行為學評分、神經元凋亡的影響。
　　方法：將32只雄性C57BL/6小鼠分為4組：MCAO組、Hsp602.5μg組、Hsp603.75μg組、Hsp605μg組，其中MCAO組處理方法同前；Hsp602.5μg組、Hsp603.75μg組、Hsp605μg組：腹腔注射Hsp60藥物1h后開始構建MCAO模型；同樣，將雄性C57B

12、L/6小鼠24只分為Sham組、MCAO組、LV+MCAO組，其中LV+MCAO組：側腦室注射TREM2-過表達慢病毒，于10d后構建MCAO模型，大腦中動脈缺血1 h后再灌，再灌注后3d取材，通過TTC染色、神經行為學評分（Longa評分）、TUNEL染色的方法評估腦功能。
　　結果：Hsp605μg組與MCAO組相比，神經行為學評分以及腦梗死容積減少均有統(tǒng)計學意義（P<0.001），TUNEL染色表明Hsp603.75μg組、

13、Hsp605μg組與MCAO組相比，凋亡細胞數量有所減少（P<0.01）。LV+MCAO組與MCAO組相比，腦梗死容積有所減少（P<0.05），M1標記物iNOS表達降低（P<0.01）而M2標記物Arg-1表達升高（P<0.001）。
　　結論：Hsp60激活TREM2的表達，能夠改善缺血再灌注后神經功能，從而發(fā)揮腦保護作用；TREM2-過表達慢病毒上調TREM2的表達，同樣發(fā)揮腦保護作用。
　　實驗五：慢病毒調控TREM

14、2的表達對氧糖剝奪模型后小膠質細胞功能活化狀態(tài)的影響
　　目的：進一步在細胞實驗中驗證調控TREM2的表達能夠改變缺血后小膠質細胞功能活化狀態(tài)。
　　方法：將N9小膠質細胞分為以下三組，control-vector組、TREM2-vector組、TREM2-siRNA組，慢病毒轉染3d后將細胞給予氧糖剝奪模型處理4h，隨后復糖復氧24h，接著收集細胞并提取細胞蛋白用Western Blot的方法檢測iNOS、IL-6、BDN