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文檔簡介
1、心腦血管疾病一直是危害人類健康的“頭號殺手”,而中國作為人口老齡化大國,缺血性腦中風的發(fā)病率居高不下,嚴重影響國民健康。自1994年,缺血性腦中風已成為中國大城市中第一位致死性疾病,每10萬人口中約有429~620人患此病,每年每10萬人口中約有116~142例死亡。腦對缺血缺氧等刺激非常敏感且耐受能力最差,是最容易發(fā)生缺血再灌注損傷的器官之一,其功能障礙對人的精神、情感、行為、意識以及幾乎所有的臟器功能均會產生不同程度的影響。腦缺血損
2、傷后的神經炎癥往往貫穿缺血再灌注損傷病理發(fā)展的全過程,強烈的神經炎癥反應造成的腦繼發(fā)性損傷是目前臨床上非常棘手的問題,因而抑制腦內神經炎癥將會為腦中風患者的治療和預后帶來曙光。小膠質細胞作為腦內免疫細胞的代表,其在神經炎癥中的功能變化受到人們的廣泛關注。在缺血再灌注損傷的不同時期,小膠質細胞的功能持續(xù)發(fā)生變化。經典激活狀態(tài)(M1 phenotype)的小膠質細胞在炎癥早期釋放大量炎癥因子及氧自由基等有害物質,破壞神經元結構的完整性和功能
3、的穩(wěn)定性;而選擇性激活狀態(tài)(M2 phenotype)的小膠質細胞則在炎癥晚期分泌一些神經營養(yǎng)物質,清除壞死或凋亡的神經元碎片,促進組織膠質瘢痕的形成以及營養(yǎng)神經元。因而調控小膠質細胞的功能活化狀態(tài)使其趨利避害,減輕腦內神經炎癥,控制疾病的發(fā)生發(fā)展,將是防治缺血后神經損傷的新目標。II型髓樣細胞激發(fā)受體(TREM2)是高表達于小膠質細胞上的一種免疫球蛋白樣受體,它在自身免疫及炎癥過程中發(fā)揮“負性調節(jié)”的有益作用。那么TREM2是不是調控
4、小膠質細胞活化狀態(tài)轉變的關鍵靶點?調控TREM2的表達能否改善腦缺血損傷后的神經功能?針對這些科學問題,我們通過體內、體外實驗證實了上調TREM2的表達可促使小膠質細胞由M1型向M2型轉變減輕神經炎癥,改善缺血后神經功能,初步闡明TREM2是調控小膠質細胞活化狀態(tài)的重要信號分子,有助于缺血性腦中風新型治療手段和藥物的研發(fā)。
實驗一:不同功能活化狀態(tài)的小膠質細胞中TREM2的表達
目的:觀察TREM2在M1和M2兩種不
5、同功能活化狀態(tài)小膠質細胞中的表達,初步明確其與M1和M2活化狀態(tài)的關系。
方法:采用LPS/IFN-γ定向誘導原代小膠質細胞向M1型轉化,L-4/IL-13定向誘導原代小膠質細胞向M2型轉化,應用Western Blot和免疫熒光染色方法檢測細胞內M1標記物iNOS、M2標記物Arg-1以及TREM2的表達。
結果:LPS/IFN-γ組iNOS表達較control組多(P<0.05),而IL-4/IL-13組Arg-
6、1表達較control組多(P<0.05),初步將小膠質細胞按功能狀態(tài)區(qū)分開來,進而發(fā)現(xiàn)TREM2在IL-4/IL-13組表達升高,且與control組相比有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。免疫熒光雙標染色結果與Western Blot近乎一致。
結論:TREM2在M2型小膠質細胞上表達升高,而在M1型小膠質細胞上表達降低。
實驗二:腦缺血損傷后小膠質細胞功能活化狀態(tài)的變化及TREM2的表達
目的:觀察腦缺血后
7、再灌注不同時間點小膠質細胞M1型和M2型標記物的變化及TREM2的表達情況。
方法:將27只SPF級雄性C57BL/6小鼠分為Sham組和MCAO組,其中MCAO組小鼠再次隨機分為4組,即構建MCAO動物模型后,于再灌注后的6h,24h,3d和7d分別取缺血半暗帶腦組織(n=6),應用Western Blot和免疫熒光染色方法檢測并觀察梗死同側區(qū)半暗帶腦組織中iNOS、IL-6、Arg-1、BDNF及TREM2的表達。
8、 結果:再灌注后6h,iNOS的表達最高(P<0.01),同樣在6h這一時間點也觀察到IL-6的表達增加(P<0.001),M1型標記物iNOS、IL-6在6h、24h均較對照組升高,M2型小標記物Arg-1和BDNF于再灌注后7d表達最高(P<0.001)。TREM2的表達隨缺血再灌注時間的延長而逐漸增高,在3d表達最高(P<0.001)。
結論:腦缺血損傷后早期以M1型小膠質細胞為主,腦缺血損傷后晚期以M2型小膠質細胞為
9、主,TREM2在缺血再灌注后3d即M1/M2過渡期表達最高。
實驗三:下調TREM2的表達對腦缺血損傷的影響
目的:探討下調TREM2的表達后對腦梗死容積、神經行為學評分、神經元凋亡的影響。
方法:雄性C57BL/6小鼠24只分為以下3組:MCAO組、siRNA組、scrRNA組,其中MCAO組處理方法同前;siRNA組、scrRNA組:側腦室注射TREM2-siRNA、control siRNA,72 h
10、后構建MCAO模型,大腦中動脈缺血1h后再灌注。缺血再灌注后3d取腦組織,通過TTC染色、神經行為學評分(Longa評分)、TUNEL染色的方法對腦功能進行評估。
結果:TUNEL染色結果顯示TREM2-siRNA組與MCAO組相比,神經元凋亡數目明顯增多(P<0.05),但TREM2-siRNA組的小鼠腦梗死容積和神經行為學評分與MCAO組無統(tǒng)計學差異。
結論:下調TREM2的表達后加重神經元的凋亡。
實
11、驗四:上調TREM2的表達發(fā)揮腦保護作用
目的:探討上調TREM2的表達后對腦梗死容積、神經行為學評分、神經元凋亡的影響。
方法:將32只雄性C57BL/6小鼠分為4組:MCAO組、Hsp602.5μg組、Hsp603.75μg組、Hsp605μg組,其中MCAO組處理方法同前;Hsp602.5μg組、Hsp603.75μg組、Hsp605μg組:腹腔注射Hsp60藥物1h后開始構建MCAO模型;同樣,將雄性C57B
12、L/6小鼠24只分為Sham組、MCAO組、LV+MCAO組,其中LV+MCAO組:側腦室注射TREM2-過表達慢病毒,于10d后構建MCAO模型,大腦中動脈缺血1 h后再灌,再灌注后3d取材,通過TTC染色、神經行為學評分(Longa評分)、TUNEL染色的方法評估腦功能。
結果:Hsp605μg組與MCAO組相比,神經行為學評分以及腦梗死容積減少均有統(tǒng)計學意義(P<0.001),TUNEL染色表明Hsp603.75μg組、
13、Hsp605μg組與MCAO組相比,凋亡細胞數量有所減少(P<0.01)。LV+MCAO組與MCAO組相比,腦梗死容積有所減少(P<0.05),M1標記物iNOS表達降低(P<0.01)而M2標記物Arg-1表達升高(P<0.001)。
結論:Hsp60激活TREM2的表達,能夠改善缺血再灌注后神經功能,從而發(fā)揮腦保護作用;TREM2-過表達慢病毒上調TREM2的表達,同樣發(fā)揮腦保護作用。
實驗五:慢病毒調控TREM
14、2的表達對氧糖剝奪模型后小膠質細胞功能活化狀態(tài)的影響
目的:進一步在細胞實驗中驗證調控TREM2的表達能夠改變缺血后小膠質細胞功能活化狀態(tài)。
方法:將N9小膠質細胞分為以下三組,control-vector組、TREM2-vector組、TREM2-siRNA組,慢病毒轉染3d后將細胞給予氧糖剝奪模型處理4h,隨后復糖復氧24h,接著收集細胞并提取細胞蛋白用Western Blot的方法檢測iNOS、IL-6、BDN
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