乙醇對氧化應(yīng)激損傷和HBV復(fù)制對肝癌系細胞蛋白酶體活性的影響.pdf

1、乙型肝炎病毒(HBV)作為一種非細胞毒性的嗜肝病毒,感染機體后將導(dǎo)致急慢性肝炎、肝硬化、肝癌等一系列肝臟疾病的發(fā)生,成為危害人類健康的一項嚴重問題。HBV感染后,決定病程轉(zhuǎn)歸的一個主要因素是機體的免疫反應(yīng)能力.尤其是特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的反應(yīng)水平。表達抗原特異性受體細胞毒性T(CD8+T)淋巴細胞能夠識別HBV感染肝細胞表面的MHC-I抗原肽段復(fù)合物,對感染細胞的病毒進行清除,當(dāng)特異性的CTL建立以后,感染的肝細胞表面如果

2、不表達MHC-Ⅰ抗原肽段復(fù)合物,也沒法對病毒進行清除,而且最近的研究指出氧化應(yīng)激損傷與丙肝病毒感染協(xié)同作用減弱了肝細胞內(nèi)負責(zé)處理加工MHC-Ⅰ抗原的蛋白酶體的活性,也有研究證據(jù)表明乙肝病毒蛋白與蛋白酶體亞基之間可以相互作用降低肝細胞本身的抗原提呈功能,有利于病毒病原體躲避機體的免疫反應(yīng)。因此乙肝病毒感染肝細胞的處理加工病毒抗原的能力有待于進一步研究證實。
　　 本研究利用肝癌細胞系HepG2以及在HepG2基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)染了HBV的H

3、epG2.2.15細胞為靶細胞模型,初步探討比較HepG2和HepG2.2.15細胞對乙醇致氧化應(yīng)激損傷的敏感性差異,通過Western bloting方法檢測LMP2免疫蛋白酶體的亞基,研究氧化應(yīng)激損傷對HepG2和HepG 2.2.15細胞處理加工病毒抗原能力的影響。實驗過程中,分別用1.5％、3％、5％、8％濃度的乙醇作用HepG2和HepG2.2.15細胞16h以后收集上清檢測谷草轉(zhuǎn)氨酶,四甲基偶氮唑鹽(MTT)計算細胞活性抑制

4、率。兩種細胞1.5％、5％乙醇處理16小時后用WesternBlot檢測免疫蛋白酶體亞基LMP2的表達。通過上述研究方案獲得如下結(jié)果:
　　 HepG2.2.15細胞對3％、5％的乙醇誘導(dǎo)損傷更敏感。HepG2.2.15細胞的LMP2表達比HepG2細胞低,1.5％乙醇處理16小時以后,HepG2.2.15細胞的蛋白酶體亞基LMP2表達比HepG2細胞下調(diào)更明顯。
　　 我們的研究提示了HBV的復(fù)制和氧化應(yīng)激損傷降低了蛋

5、白酶體亞基LMP2的表達,推測HBV的復(fù)制可能會造成肝細胞的氧化應(yīng)激損傷,會減弱肝細胞的對MHC-Ⅰ類分子限制的病毒抗原的提呈。
　　 目的:建立一種簡便經(jīng)濟的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的原代肝細胞的分離純化方法,并進行培養(yǎng),觀察HBV轉(zhuǎn)基因小鼠原代肝細胞的生物學(xué)功能,探索HBV轉(zhuǎn)基因小鼠原代肝細胞作為抗乙肝病毒藥物藥效學(xué)研究的細胞模型的潛能。
　　 方法:采用稍加改良的兩步膠原酶灌流法分離獲取HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的肝細胞,用perc

6、oll密度梯度離心法純化原代肝細胞,并進行原代培養(yǎng)。以臺盼藍染色法測細胞活力,顯微鏡下觀察肝細胞形態(tài)變化,檢測培養(yǎng)體系不同時間培養(yǎng)上清液中白蛋白、乳酸脫氫酶(LDH)、尿素的含量以及不同時間培養(yǎng)上清液中乙肝表面抗原(HBS-Ag)、e抗原(HBe-Ag)、HBVDNA分泌水平,利用HBV轉(zhuǎn)基因小鼠原代肝細胞模型,通過檢測培養(yǎng)上清HBS-Ag、HBe-Ag、HBVDNA分泌水平對Bay-4109的抗乙肝病毒作用進行藥效學(xué)評價。
　　

7、 結(jié)果:改良的兩步膠原酶消化法結(jié)合percoll密度梯度離心法所獲取的肝細胞活細胞達到90％,純度95％以上,貼壁良好、活性高、功能強:LDH漏出量、白蛋白分泌及尿素合成等指標(biāo)在1周內(nèi)呈現(xiàn)規(guī)律性變化,第3和第4天時LDH漏出量最低,白蛋白分泌及尿素合成功能正常,HBS-Ag在一周內(nèi)分泌水平穩(wěn)定、HBe-Ag在1～2天分泌高峰、后逐漸下降,HBVDNA分泌水平表明所分離的肝細胞在培養(yǎng)第3～4天功能最佳。Bay-4109作用于HBV轉(zhuǎn)基因