Wnt5a信號通路在結腸癌血管生成擬態(tài)及EMT中的作用.pdf

1、研究背景和目的:
　　結腸癌是世界范圍內發(fā)病較為廣泛的惡性腫瘤之一，腫瘤的轉移和復發(fā)嚴重威脅結腸癌病人的生命。腫瘤的生長以及轉移需依賴腫瘤組織中的血管生成。血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry, VM)是一種不依賴內皮細胞的全新腫瘤微循環(huán)模式，已有研究報道發(fā)現(xiàn)多種惡性腫瘤中存在VM，如肝癌、前列腺癌、卵巢癌等。前期研究結論證實結腸癌中存在VM，且VM與腫瘤的惡性度相關，與臨床不良預后有關。結腸癌中VM的詳細形成機

2、制至今不明，已有研究結果證實上皮間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)以及經典Wnt/β-catenin信號通路的過度活化在結腸癌VM形成中起重要作用。本課題組前期研究已發(fā)現(xiàn)在結腸癌組織中存在Wnt/β-catenin信號通路的過度活化并且參與啟動EMT。已有研究報道稱非經典Wnt信號通路可促進腫瘤細胞遷移，通過激活轉錄因子啟動EMT。非經典Wnt信號通路中最重要的Wnt分泌蛋白Wnt5

3、a在胃癌、乳腺癌、前列腺癌等中存在促進腫瘤的侵襲和轉移的作用，Wnt5a可促進多種腫瘤細胞發(fā)生EMT。而非經典Wnt信號通路在結腸癌中的作用研究卻相對甚少且不一致，因此我們遴選非經典Wnt信號通路中Wnt5a作為研究對象，探討Wnt5a信號通路在結腸癌VM形成機制中可能存在的作用。
　　本研究利用免疫組化技術初步分析了217例結腸癌病例組織中Wnt5a的表達情況，并結合前期實驗結果進一步探討Wnt5a與EMT相關蛋白以及VM形成的

4、關系，并利用細胞轉染技術、分子生物學技術及免疫缺陷小鼠腫瘤細胞移植瘤模型進一步探究Wnt5a對結腸癌細胞EMT及VM形成的影響，以期闡明非經典Wnt信號通路在結腸癌中的作用。
　　研究方法:
　　1)免疫組織化學染色方法檢測217例結腸癌組織標本中Wnt5a的表達，并結合臨床病理資料以及生存情況隨訪記錄結果，分析Wnt5a的表達與臨床病理特征的關系以及.Wnt5a的表達與患者生存預后的關系。結合前期試驗結果，分析Wnt5a的

5、表達與結腸癌中EMT相關蛋白E-cadherin以及Vimentin的關系，以及與結腸癌中經典Wnt/β-catenin信號通路關鍵調控蛋白β-catenin的關系。
　　2)建立異常Wnt5a基因表達的結腸癌細胞系，驗證Wnt5a基因過表達以及降表達效果，篩選穩(wěn)定過或者降表達Wnt5a的結腸癌HCT116細胞。
　　3) Western Blot以及免疫熒光檢測Wnt5a對結腸癌EMT以及經典Wnt/β-catenin信號

6、通路的影響。
　　4)MTT實驗以及軟瓊脂克隆形成實驗驗證Wnt5a對HCT116細胞增殖能力的影響作用;劃痕實驗以及侵襲實驗檢測Wnt5a對HCT116細胞運動遷移以及侵襲能力的影響;細胞粘附實驗檢測Wnt5a對細胞粘附的作用。
　　5)動物實驗體內檢測Wnt5a對結腸癌細胞體內成瘤能力的影響，并以免疫組化染色方法檢測移植瘤中EMT相關蛋白的表達。
　　6)細胞流式術檢測Wnt5a對結腸癌細胞內鈣離子濃度的影響作用。

7、
　　7)通過細胞三維培養(yǎng)技術檢測Wnt5a對結腸癌細胞成管能力的影響，并通過Real-time PCR以及Western Blot檢測Wnt5a對血管生成相關蛋白的作用。
　　結果:
　　1) Wnt5a在結腸癌中表達下降，Wnt5a陽性表達與患者的良好臨床預后有關。Wnt5a的表達與結腸癌EMT相關蛋白呈負性相關關系。Wnt5a可能通過抑制經典Wnt/β-catenin信號通路活化來抑制EMT。Wnt5a在VM陰性

8、患者的表達比率較高，提示Wnt5a可能抑制結腸癌中VM的形成。
　　2) Wnt5a在結腸癌細胞系中普遍呈低表達狀態(tài)，成功構建基因調控Wnt5a表達的結腸癌HCT116細胞。
　　3) Wnt5a可通過下調EMT相關的轉錄因子抑制結腸癌細胞EMT過程，結腸癌細胞系HCT116中過表達Wnt5a后可拮抗經典Wnt/β-catenin信號通路。
　　4) Wnt5a過表達可明顯抑制HCT116細胞的增殖;Wnt5a可抑制結

9、腸癌細胞的侵襲和遷移能力;Wnt5a可增強細胞粘附能力。
　　5) Wnt5a抑制體內小鼠體內移植瘤的生長，且抑制瘤體組織中EMT相關蛋白的表達。
　　6) Wnt5a可促進細胞內鈣離子濃度升高，從而激活Wnt/Ca2+信號途徑。
　　7) Wnt5a抑制HCT116細胞管道樣結構的形成能力，并抑制促血管生成因子蛋白水平的表達。
　　結論:
　　Wnt5a作為抑癌基因在結腸癌中呈普遍性低表達或者失表達，Wn