青蒿琥酯增強小鼠腹腔巨噬細胞內化清除內毒素、大腸埃希菌的作用及其機制研究.pdf

1、膿毒癥(sepsis)是嚴重燒傷、創(chuàng)傷、感染、休克和大手術等后常見的并發(fā)癥，進一步發(fā)展可導致膿毒性休克、多器官系統(tǒng)功能障礙綜合征(multiple organ dysfuctionsyndrome，MODS)，是臨床危重患者的主要死亡原因之一，病死率高達50%-80%，目前尚無有效的治療手段。脂多糖/內毒素(lipopolysaccharide/endotoxin，LPS)是革蘭陰性菌外膜的主要成分，是導致膿毒癥(sepsis)的主要致

2、病因子。LPS可通過與TOLL樣受體4(Toll-like receptors4，TLR4)、清道夫受體(scavenger receptor，SR)等模式識別受體結合后內化入胞實現LPS的降解清除，并激活單核/吞噬細胞系統(tǒng)，誘導NF-κB、MAPK信號轉導通路的的活化，引起過度的炎癥反應從而誘導膿毒癥的發(fā)生。單核/吞噬細胞系統(tǒng)可識別、內化LPS，也可直接吞噬、消化細菌。
　　 尋找拮抗LPS的藥物是世界各國科學家們研究的熱點。

3、青蒿琥酯(artesunate，AS)為青蒿素的水溶性衍生物，在抗瘧、抗腫瘤、調節(jié)免疫力等方面有廣泛應用。本課題組前期研究發(fā)現青蒿琥酯可通過降低血清LPS水平保護膿毒癥模型小鼠，并可明顯降低熱滅活大腸埃希菌攻擊膿毒癥模型小鼠死亡率，但體外實驗發(fā)現青蒿琥酯并不能直接結合、中和LPS。因此，我們推測青蒿琥酯保護膿毒癥模型小鼠、降低血清LPS水平的機制可能與其增加單核/吞噬細胞系統(tǒng)的內化清除能力有關。
　　 目的
　　 以小鼠

4、腹腔巨噬細胞為研究對象，探討青蒿琥酯對小鼠腹腔巨噬細胞內化清除LPS、大腸埃希菌能力的影響及其可能機制。
　　 方法
　　 1.青蒿琥酯增強小鼠腹腔巨噬細胞內化清除內毒素、大腸埃希菌的的作用研究
　　 (1)小鼠腹腔巨噬細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定。
　　 (2)應用激光共聚焦顯微鏡觀察青蒿琥酯、網格蛋白抑制劑MDC、內體酸化抑制劑氯喹對小鼠腹腔巨噬細胞內化FITC-LPS的影響。
　　 (3)應用激光

5、共聚焦顯微鏡和菌落集落形成記數實驗觀察青蒿琥酯對小鼠腹腔巨噬細胞內化清除大腸埃希菌的影響。
　　 2.青蒿琥酯增強小鼠腹腔巨噬細胞內化清除內毒素、大腸埃希菌的作用機制研究
　　 (1)應用ELISA法觀察青蒿琥酯、MDC、氯喹處理對LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞TNF-α、IL-6釋放的影響。
　　 (2)應用RT-PCR技術檢測小鼠腹腔巨噬細胞經青蒿琥酯、LPS處理前后、TLR4、SRs mRNA以及AOAH m

6、RNA表達的變化。
　　 (3)應用FAM技術檢測青蒿琥酯對LPS刺激的小鼠腹腔巨噬細胞膜上TLR4、SRs受體表達的影響。
　　 結果
　　 1.青蒿琥酯增強小鼠腹腔巨噬細胞內化清除內毒素、大腸埃希菌的的作用研究
　　 (1)成功分離了小鼠腹腔巨噬細胞，且細胞純度、活力符合實驗要求。
　　 (2)青蒿琥酯能夠增加小鼠腹腔巨噬細胞對LPS的內化，且在MDC、氯喹存在的情況下仍可增加小鼠腹腔巨噬細胞

7、對LPS的內化。
　　 (3)青蒿琥酯能夠增加小鼠腹腔巨噬細胞對大腸埃希菌的內化與清除。
　　 2.青蒿琥酯增強小鼠腹腔巨噬細胞內化清除內毒素、大腸埃希菌的作用機制研究
　　 (1)小鼠腹腔巨噬細胞分別經青蒿琥酯、MDC、氯喹處理后，LPS刺激所致的TNF-α、IL-6釋放被顯著抑制；且青蒿琥酯與MDC、氯喹共同作用可進一步增強這種抑制作用。
　　 (2)青蒿琥酯對小鼠腹腔巨噬細胞TLR4、SR-A、MA

8、RCO、SR-BⅠ及AOAH mRNA的表達均有影響。
　　 (3)青蒿琥酯不影響小鼠腹腔巨噬細胞胞膜上TLR4、SRs的表達。
　　 結論
　　 1.青蒿琥酯能夠增強小鼠腹腔巨噬細胞內化LPS的能力，且在網格蛋白抑制劑、內體酸化抑制劑存在的情況下仍可增強小鼠腹腔巨噬細胞內化LPS的能力。
　　 2.青蒿琥酯能夠增加小鼠腹腔巨噬細胞對大腸埃希菌的內化與清除。
　　 3.青蒿琥酯增加小鼠腹腔巨噬細胞