去整合素金屬蛋白酶33在哮喘中的作用及其與干擾素γ的相關性研究.pdf

1、研究背景: 支氣管哮喘(簡稱哮喘)是由多種細胞和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病。全世界大約有3億哮喘患者，所有哮喘患者包括兒童在內，都存在氣道重塑，氣道重塑的發(fā)生在臨床癥狀出現(xiàn)之前就已經存在。主要表現(xiàn)為上皮下纖維化，包括氣道平滑肌細胞增生和肥大、氣道壁血管的增生，以及粘液分泌增加。引起哮喘患者氣道重塑的原因尚不十分清楚。目前針對哮喘的治療主要分為控制發(fā)作用藥和急救用藥，尚沒有藥物可以逆轉哮喘患者的氣道重塑。 去整合素金

2、屬蛋白酶(ADAM)33是最近發(fā)現(xiàn)的ADAM家族成員，定位于第20號染色體短臂13號位(20p13)，編碼一種金屬蛋白酶，可能參與氣道的重塑。ADAM33是一個高度多態(tài)性的基因，含有70多個單核苷酸多肽位點。其中許多位點已經被證實與氣道高反應性和哮喘有關。ADAM33主要在平滑肌細胞、成肌纖維細胞和成纖維細胞中表達，而在上皮細胞、T淋巴細胞或炎癥細胞中表達較少。ADAM33在間充質細胞中的選擇性表達，說明其活性改變可能會導致氣道平滑肌細

3、胞和成纖維細胞的功能異常，因此推測ADAM33可能與氣道重塑有關。ADAM33在慢性哮喘模型中的作用，目前尚無相關報道。 哮喘是一種以Th1/Th2細胞因子表達失衡為特點的氣道變應性炎癥性疾病，表現(xiàn)為Th2反應增強，Th1反應減弱。干擾素-γ(IFN-γ)是Th1型細胞因子，在哮喘的發(fā)病機制中起重要作用：主要表現(xiàn)為強烈抑制Th2細胞因子(IL-4，IL-13)的活性，調節(jié)Th1/Th2平衡；在哮喘患者的肺泡灌洗液(BALF)中，

4、：IFN-γ的水平明顯低于正常人：IFN-γ可以明顯減輕哮喘模型的氣道高反應性。 IFN-γ也參與了肺部疾病氣道重塑。IFN-γ可以減輕病毒性細支氣管炎導致的氣道炎癥、氣道重塑和肺阻力及動態(tài)順應性的改變；在博來霉素所致的肺纖維化小鼠模型中，IFN-γ可以明顯抑制成纖維細胞的增生和膠原沉積；在特發(fā)性肺間質纖維化患者中，給予IFN-γ治療可以降低IFN-β1和結締組織生長因子基因的表達水平，從而提高患者的肺功能和血氣水平。然而在慢性

5、哮喘模型中，IFN-γ與氣道重塑的關系報道甚少。 在過敏源所致的急性哮喘模型中，針對一種或多種細胞因子，已經進行了大量的研究，并且取得了良好的效果。但是應用于臨床后的結果卻令人大失所望。試驗與臨床不一致的原因可能是由于，人類哮喘是一種慢性疾病，而動物模型是一種短期激發(fā)所導致的急性模型或者是基因敲除所致的某種細胞因子缺乏的模型。因此，若要評價一種干預方案是否可靠，必須建立與人類疾病更為相似的慢性氣道疾病模型。 本研究構建了

6、小鼠慢性氣道重塑哮喘模型，以重組小鼠IFN-γ（rm IFN-γ)和腺病毒載體介導小鼠IFN-γ(AdCMVmIFN-γ)干預，觀察其在體內對ADAM33表達的及氣道重塑的影響。在體外培養(yǎng)的小鼠成纖維細胞系中，給予rmIFN-γ和AdCMVmIFN-γ干預，觀察其直接對ADAM33表達的調節(jié)作用；同時，為進一步研究ADAM33基因的功能，本實驗還構建了ADAM33-短發(fā)卡RNA(shRNA)慢病毒質粒表達載體，成功敲低了成纖維細胞中AD

7、AM33基因的表達，為下一步構建ADAM33基因敲低試驗動物，進一步探索ADAM33基因在哮喘中的作用提供了有力的工具。 第一章干擾素Y對小鼠哮喘模型去整合素金屬蛋白酶33的調節(jié)作用 目的:探討預防性和治療性給予腺病毒載體介導轉基因表達小鼠γ干擾素(AdCMVmIFN-γ)和重組mIFN-γ(rmIFN-γ)在卵蛋白所致小鼠氣道重塑哮喘模型中對ADAM33表達及氣道重塑的影響。 方法:C57BL/6小鼠于第0、1

8、4天以卵蛋白(Ovalbumin，OVA)腹腔注射致敏，從第24天開始霧化吸入2.5％的OVA激發(fā)并持續(xù)18天，建立氣道重塑模型。分別預防性給予(抗原激發(fā)前一天)和治療性給予(第一次抗原激發(fā)后18天)AdCMVmIFN-γ和rmIFN-γ。用半定量逆轉錄一聚合酶鏈式反應和蛋白免疫印跡法檢測ADAM33的表達，同時對肺組織切片行蘇木精一依紅(HE)和Masson染色，測定氣道平滑肌厚度和膠原面積。 結果:OVA致敏/激發(fā)的小鼠模型

9、肺組織中呈明顯以嗜酸性粒細胞為主的炎性浸潤、平滑肌肥厚、膠原沉積和ADAM33高表達。預防性給予AdCMVmIFN-γ轉基因表達mIFN-γ可明顯改善上述變化。而在氣道重塑形成后治療性給予AdCMVmIFN-γ轉基因表達mIFN-γ干預和rmIFN-γ可部分下調ADAM33表達和氣道重塑發(fā)生。 結論:ADAM33在哮喘平滑肌肥厚和膠原沉積過程中可能起一定作用；腺病毒介導mIFN-γ道內局部轉基因表達的預防性干預可明顯抑制ADAM

10、33的表達，減輕氣道重塑；氣道重塑形成后的治療性干預可部分下調ADAM33表達和減輕氣道重塑。 第二章干擾素γ對小鼠成纖維細胞中ADAM33的調節(jié)作用 目的:探討IFN吖在小鼠成纖維細胞系(NIH/3T3)AD對ADAM33基因表達的影響。 方法:以不同濃度的腺病毒載體介導轉基因表達小鼠γ干擾素(AdCMVmIFN-γ)和重組組mIFN-γ(rmIFN-γ)在不同時間干預NIH/3T3細胞系，采用ELISA方法檢

11、測細胞培養(yǎng)液中mIFN-γ的含量，以RT-PCT和Western-Blot方法檢測細胞中ADAM33mRNA和蛋白質的表達水平。 結果:AdCMVmIFN-γ轉基因表達mIFN-γ和rmIFN-γ均呈濃度和時間依賴模式抑制ADAM33mRNA和蛋白質的表達水平。rmIFN-γ組，24-48小時ADAM33 mRNA和蛋白質的表達水平開始逐漸恢復；AdCMVIFN-γ轉基因表達mIFN-γ對ADAM33 mRNA和蛋白質的抑制可以

12、持續(xù)到96小時。 結論:IFN-γ可以以時間依賴模式和濃度依賴模式抑制NIH/3T3細胞系中ADAM33的表達；AdCMVmIFN-γ轉基因表達mIFN-γ較rIFN-γ的作用時間更長。 第三章應用短發(fā)卡RNA慢病毒質粒載體抑制去整合素金屬蛋白酶33表達 目的:針對不同靶點的ADAM33 DNA基因組，在不同區(qū)域構建shRNA慢病毒真核表達載體，篩選出ADAM33特異、高效的shRNA片段，抑制ADAM33基因的

13、表達。 方法:分別在ADAM33基因的前體結構域、金屬蛋白酶域和跨膜結構域內，設計4對不同靶點的特異性shRNA序列，構建相應的真核表達載體(pGCL-GFP shRNAl、2、3、4)。分別將這4種質粒瞬時轉染入小鼠成纖維細胞3T3中。在轉染后24、48和72小時分別采用倒置熒光顯微鏡觀察轉染效率、半定量RT-PCR和免疫印跡的方法檢測細胞中ADAM33基因及蛋白的表達水平。 結果:重組質粒經測序證實，其插入序列與目的

14、序列完全一致，說明重組載體構建成功。與對照組相比，pGCL-GFP shRNA3轉染48小時后，對ADAM33基因和蛋白表達的干擾效果明顯，分別達49.3±2.52％和30.1±5.51％。而1、2和4號載體干擾效果相對較弱。 結論:本研究建立了ADAM33 pGCL-GFP shRNA慢病毒質粒載體，成功干擾了ADAM33基因和蛋白的表達，為下一步制備ADAM33基因敲降的實驗動物，研究ADAM33在哮喘發(fā)病中的作用提供了有力