卡介苗(BCG)對人NK細胞功能的調(diào)節(jié)作用及其機制的研究.pdf

1、目的： 卡介苗(bacillus Calmette—Guerin，BCG)是一種活的減毒牛型結核分支桿菌疫苗，除應用于結核病的預防接種外，還可以作為一種非特異性及特異性的細胞免疫增強劑應用于腫瘤的治療，并且取得了公認的顯著療效，但是其抗腫瘤的確切機制并不完全清楚。迄今為止，國內(nèi)外文獻報道主要集中在對BCG本身及其作用于T淋巴細胞、抗原提呈細胞和腫瘤細胞等的研究，而BCG對自然殺傷細胞(nature killer cell，NK)

2、的作用仍不清楚。NK細胞是固有免疫的重要組成成分，能夠殺傷病毒感染的細胞和腫瘤細胞，并且具有免疫調(diào)節(jié)功能。本課題擬研究BCG對人NK細胞功能的調(diào)節(jié)作用及其機制，為探討B(tài)CG抗腫瘤機制提供理論和實驗依據(jù)。 研究對象和方法： 1.研究對象：志愿者43例，其中男23例，女20例，年齡范圍21-43歲，平均年齡30.3歲，均為抗結核抗體陰性。本課題已取得所有志愿者知情同意，并簽署正式的知情同意書。 2.方法：無菌抽取外周

3、靜脈血10-20mL，肝素(15～25U/mL血)抗凝。用Ficoll進行密度梯度離心，獲取外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)。 2.1將PBMC不加或加BCG培養(yǎng)，利用ELISA方法檢測培養(yǎng)上清液IFN—γ、TNF—α含量；利用ELISpot方法在單個細胞水平上檢測IFN—γ、顆粒酶B產(chǎn)生細胞的頻率；以K562為靶細胞，利用四甲基偶氮唑鹽比色法(monotetra

4、zolium test，MTT)測定PBMC殺傷功能。 2.2利用免疫磁珠法純化NK細胞。將PBMC和NK細胞不加或加BCG、IL-12、PMA+Ionomycin培養(yǎng)，利用ELISA方法檢測培養(yǎng)上清液IFN—γ、TNF—α含量；以K562為靶細胞，利用MTT法測定NK細胞殺傷功能。 2.3將PBMC不加或加不同濃度BCG培養(yǎng)，利用ELISA方法檢測培養(yǎng)上清液IL-12p40含量；利用流式細胞術檢測NK細胞IL-12Rβ

5、1的表達。觀察抗IL-12受體β1 mAb(2B10)對BCG作用于PBMC產(chǎn)生IFN—γ及分泌顆粒酶B的影響。 3.統(tǒng)計學分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行獨立樣本t檢驗分析，顯著性檢驗標準為P<0.05。 結果： 1.BCG呈劑量依賴的方式誘導PBMC產(chǎn)生IFN—γ和TNF—α。 2.BCG刺激條件下PBMC顆粒酶B分泌細胞數(shù)明顯高于不加任何刺激劑組(P<0.05)。BCG增強正常人PBM

6、C殺傷K562細胞的活性，并且隨著效靶比的增高而增強。BCG濃度為0.2μg/ml時即可促進PBMC的殺傷功能，2μg/ml時作用最顯著，20μg/ml時促進作用下降。 3.BCG不能誘導純化NK細胞產(chǎn)生IFN—γ，但與IL-12同時刺激則表現(xiàn)出協(xié)同作用。純化NK細胞在不加任何刺激劑及BCG、IL-12和BCG+IL-12分別刺激等四種條件下均不產(chǎn)生TNF—α。 4.純化NK細胞經(jīng)BCG刺激后殺傷K562的活性略高于未刺

7、激的NK細胞，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 5.BCG呈劑量依賴方式誘導PBMC產(chǎn)生IL-12、并促進NK細胞不同亞群表達IL-12Rβ1。 6.在BCG中加入抗IL-12受體β1 mAb(2B10)后，PBMC分泌IFN—γ明顯低于單獨BCG刺激組(P<0.001)，但仍高于不加任何刺激劑組(P<0.01)；PBMC分泌顆粒酶B細胞數(shù)明顯減少(與單獨BCG刺激組相比，P<0.05)。 結論： 1

8、.BCG誘導抗結核抗體陰性正常人PBMC產(chǎn)生IFN—γ和TNF—α。當BCG和IL-12共同刺激時表現(xiàn)為協(xié)同作用。BCG促進正常人PBMC顆粒酶B分泌細胞數(shù)增加，增強PBMC殺傷K562細胞的活性。 2.BCG單獨刺激不能誘導正常人純化NK細胞產(chǎn)生IFN—γ和TNF—α，但能顯著增加IL-12誘導NK細胞產(chǎn)生IFN—γ。BCG不能增強純化NK細胞殺傷K562的活性。 3.對BCG作用于正常人NK細胞機制的研究表明，BCG