P73對sirtuin家族基因轉錄和蛋白表達調控研究.pdf

1、Sirtuins或沉默信息調節(jié)蛋白2（silencing information regulator2，Sir2）類似酶被定義為一個煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴型的組蛋白去乙?；傅募易澹@個家族基因與能量代謝、氧化狀況等密切相關，是細胞中有關壽命的熱點基因。大量研究證實Sirtuins在基因沉默、DNA損傷修復、有絲分裂調控及抗凋亡等方面起到了重要的作用。
　　 P73作為細胞內一個重要的轉錄因子，是p53家族中的一員，與抑癌基因

2、p53有著許多的相似點，包括調控的下游靶基因，誘導細胞凋亡，引起細胞周期停滯等。同時其p73缺失小鼠不同于p53缺失小鼠，它不會形成自發(fā)性腫瘤，但是存在一些發(fā)育缺陷，這表明p73可能在神經和免疫系統(tǒng)的發(fā)育中也起到了一定的作用。其本身存在多種剪切體，本文中主要研究的是P73a、p73β。
　　 在本文中，為了研究分析p73對于Sirtuins家族成員在轉錄水平上的影響，我們首先采用了雙熒光素酶報告系統(tǒng)進行分析。我們構建了一系列Si

3、rtuins家族基因啟動子片段和熒光素酶報告載體相連的重組質粒，將其在293T細胞中表達，我們發(fā)現p73的兩類主要的異構體P73a、p7313能不同程度的上調Sirtuins家族成員啟動子所介導的熒光素酶的活性。
　　 為進一步證明此結論，我們選用了逆轉錄PCR(RT-PCR)方法克隆了人類的Sirtuins家族成員編碼序列。我們發(fā)現P73a、p73p可以不同程度激活sirtuin家族基因的轉錄，上調其mRNA水平表達。

4、　　 此后，利用免疫印跡實驗，發(fā)現在293T細胞中p73的兩類主要的異構體P73a、p73D并不能如我們預期所料上調Sirtuins家族蛋白水平。由于p73蛋白內源表達量較少，不易檢測。因此我構建了pGEX-4T1-P73a融合質粒，體外純化蛋白，通過自制抗體的方法解決這個問題。同時，在p73基因的不同位點構建了3個RNA干擾質粒，檢測在抑制內源性p73表達情況下，對Sirtuins家族基因的轉錄、翻譯的影響。本文為揭示Sirtuin