蛋白酶體在腹主動脈瘤發(fā)病中的作用及分子病理機制研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　腹主動脈瘤（AAA）是老齡化社會的常見病，并且隨著人群平均年齡日趨增加，AAA的發(fā)病率漸呈增高趨勢。AAA危害巨大，一旦破裂致大出血，則死亡率達60～80％，造成生命及財產的巨大損失。炎癥（淋巴細胞及巨噬細胞的浸潤活化）、膠原及彈力纖維的破壞、平滑肌細胞(SMC)數量質量、和動脈壁新生血管的形成等均是AAA發(fā)生的關鍵環(huán)節(jié)。但是調節(jié)動脈壁炎癥及SMC功能的內在分子機制仍不完全清楚。近年來，許多研究提示，泛素蛋白

2、酶體系統，特別是蛋白酶體的活性變化在細胞炎癥因子的釋放及細胞凋亡等現象中起著關鍵作用。蛋白酶體是負責降解細胞內靶蛋白的主要“構件”，一種能夠水解多聚泛素化蛋白的功能復合體。蛋白酶體活性變化多能夠參與到調控炎癥反應、影響SMC的凋亡等機制中。蛋白酶體活性的專門抑制劑硼替佐米(Bortezomib，BTZ)已經發(fā)現可通過調控細胞內蛋白酶體活性影響炎癥細胞及SMC的功能變化，但是蛋白酶體在調節(jié)AAA形成相關的病理機制的作用，尚未見報道。因此，

3、本研究擬在人及動物模型的主動脈組織中檢測動脈壁內蛋白酶體活性變化，通過BTZ抑制主動脈內蛋白酶體活性，探討蛋白酶體在AAA形成過程中參與炎癥及SMC表型變化的相關作用及分子機制。
　　實驗方法:
　　(1)收集人AAA病變及對照動脈組織;(2)通過對雄性缺陷小鼠(ApoE-/-)皮下埋植血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)緩釋泵（1，000 ng/min/kg）的方法，復制動物AAA模型;藥物處理則進行腹腔注射BTZ（50μg/kg，每

4、周2次），因此小鼠分成四組:Control，BTZ，AngⅡ，AngⅡ+BTZ。采用免疫染色、PCR分析的方法分析動脈組織內蛋白酶體各亞基表達水平(包括β1、β2、β5、β1i、β2i、β5i)，通過試劑盒測定蛋白酶體各蛋白酶活性（包括半胱天冬氨酸酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶3種酶活性）;通過測量血管超聲、鼠尾監(jiān)測血壓及大體解剖觀察各組小鼠體內動脈大體形態(tài)及血壓變化;通過HE染色、VVG染色和免疫組織化學染色法觀察各組小鼠組織結構的變化和炎癥

5、細胞浸潤（包括巨噬細胞和CD4+T細胞）;通過PCR分析、免疫組織染色分析各組小鼠動脈壁內炎癥因子表達水平(包括TNF-α，IFN-γ，IL-4，IL-6和MCP-1);通過免疫熒光染色αSMA與TUNEL或pCNA共染色確定主動脈壁內SMC的凋亡或增值狀態(tài)，通過PCR分析、免疫組織染色和Westernblot方法分析各組小鼠動脈壁內SMC表型標識物表達水平及心肌素(myocardin)明確調控SMC表型的分子機制。
　　結果:<

6、br>　　1.人AAA標本中蛋白酶體亞基表達水平及活性均增加;
　　2.AngⅡ刺激誘導ApoE-/-小鼠建立成功誘導建立AAA動物模型，檢測動脈內蛋白酶體表達及活性情況，隨著疾病進展，蛋白酶體亞基表達水平及活性均增;
　　3.BTZ抑制蛋白酶體活性后顯著抑制AngⅡ誘導的小鼠AAA形成（發(fā)生率及直徑）;
　　4.蛋白酶體抑制后抑制AngⅡ誘導的①動脈壁內基質金屬蛋白酶的表達及活性;②血管重塑及彈力纖維降解;③血管壁內

7、炎癥;
　　5.蛋白酶體抑制后抑制AngⅡ誘導的血管壁內SMC增殖但并不影響其凋亡;
　　6.蛋白酶體抑制后逆轉AngⅡ誘導動脈壁內SMC表型轉化。
　　結論:
　　我們證明了蛋白酶體的活化在促進體內AAA形成了關鍵的作用。其發(fā)揮作用與血管緊張素Ⅱ誘導的炎性細胞浸潤，MMP活性增加，及SMC表型轉化相關。低劑量的蛋白酶體抑制劑BTZ有效抑制這些改變。這些發(fā)現，明確了蛋白酶體參與AAA發(fā)生的病理生理學機制，也使得B