COPS3基因在肝癌細(xì)胞增殖中的功能研究.pdf

1、目的：COPS3(COP9 signalosome complex subunit3,CSN3)基因是COP9信號(hào)復(fù)合體(COP9 signalosome complex)的第三個(gè)亞基,位于人類17號(hào)染色體。近年來的研究發(fā)現(xiàn)染色體17p的擴(kuò)增與p53位點(diǎn)的雜合子丟失、p53等位基因缺失與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。已有研究表明,高度惡性骨腫瘤樣本中可以檢測(cè)到COPS3擴(kuò)增及過表達(dá)。而目前尚未有COPS3基因是否參與肝癌發(fā)生的報(bào)道。本研

2、究探討COPS3基因在肝癌發(fā)生和發(fā)展中的作用。
　　方法：采用免疫組化法,檢測(cè)30例肝癌組織和30例肝硬化組織中COPS3蛋白的表達(dá)水平和細(xì)胞內(nèi)定位。采用RNA干擾技術(shù),設(shè)計(jì)COPS3基因靶向小干擾RNA序列,構(gòu)建小發(fā)夾RNA(shRNA),重組含有COPS3 shRNA的慢病毒表達(dá)載體,與慢病毒包裝輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,包裝慢病毒,測(cè)定病毒滴度并通過Western Blot方法驗(yàn)證有效的siRNA靶序列。選擇最佳的siRN

3、A序列,包裝慢病毒感染SMMC-7721和Hep3B肝癌細(xì)胞,進(jìn)行體外MTT、BrdU、克隆形成、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡檢測(cè),并建立肝癌移植小鼠模型,進(jìn)行成瘤實(shí)驗(yàn)。為進(jìn)一步探討COPS3在肝癌細(xì)胞增殖和凋亡中的作用,利用Western Blot方法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá),初步探討COPS3基因調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。
　　結(jié)果：免疫組化結(jié)果表明,COPS3蛋白在肝癌組織中和肝硬化組織中的表達(dá)高于正常肝組織,且肝癌組織中的表達(dá)顯著高于

4、肝硬化組織;COPS3蛋白在癌變的肝組織中主要定位于細(xì)胞核,而在正常肝組織中主要定位于細(xì)胞漿。為探討COPS3基因在肝癌細(xì)胞生長中的作用,設(shè)計(jì)COPS3靶向shRNA序列,包裝成滴度為2×108TU/ml慢病毒,有效感染SMMC-7721和Hep3B肝癌細(xì)胞,并在mRNA和蛋白水平下調(diào)肝癌細(xì)胞COPS3的表達(dá)。COPS3沉默導(dǎo)致肝癌細(xì)胞活力,DNA合成水平、克隆形成能力顯著降低,并引起細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期,同時(shí)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。C

5、OPS3沉默還可導(dǎo)致裸鼠體內(nèi)肝癌移植瘤的生長減緩。此外,COPS3下調(diào)的肝癌細(xì)胞中,凋亡分子Caspase8、BIK的表達(dá)上調(diào)、PARP蛋白發(fā)生裂解。
　　結(jié)論：COPS3在肝癌組織中表達(dá)水平和定位均發(fā)生改變,可能參與肝癌的發(fā)生和發(fā)展過程。COPS3沉默(COPS3 shRNA)可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞周期阻滯、調(diào)節(jié)Caspase8、PARP和BIK的活性,促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡,抑制肝癌細(xì)胞增殖,結(jié)果提示COPS3基因是促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長的癌基因