硝化對胰島素結構、功能影響的研究.pdf

1、糖尿病是一種常見的易發(fā)性代謝疾病。越來越多的證據(jù)表明，活性氧和活性氮介導糖尿病及其并發(fā)癥的病理過程。蛋白質酪氨酸硝化是一種重要的蛋白質翻譯后修飾，它與炎癥、心血管疾病和神經退行性疾病等多種病癥相關。過氧亞硝酸根(ONOO-)路徑是促使蛋白質硝化最主要的一種途徑，其反應為自由基機理。與糖尿病相關的蛋白質硝化已有較多文獻報道，這不僅表現(xiàn)在硝基酪氨酸(NT)水平的增高，也有特定的硝化蛋白被發(fā)現(xiàn)。胰島素是由脊椎動物胰腺β細胞分泌的一種多功能蛋白

2、質激素，是治療糖尿病最有效的藥物。ONOO-可能會在β細胞內形成，對細胞造成損傷，而胰島素也可能成為氧化應激條件下ONOO-的一個靶點。目前有關ONOO-對胰島素及其信號轉導系統(tǒng)影響的報道還較少。 本文研究了體外ONOO-對胰島素的硝化反應，探討了硝化對胰島素結構、功能的影響，并對抗氧化劑等因素對胰島素硝化作用的影響進行了研究，取得了以下主要結果： ⑴采用紫外可見光譜、凝膠電泳、免疫印跡以及質譜等對胰島素的硝化產物進行了

3、表征，并考察了pH 值、CO2、鐵配合物等因素以及白蛋白對該反應的影響。 結果顯示ONOO-可以硝化胰島素酪氨酸(Tyr)殘基，且隨濃度的不斷增大，胰島素4個酪氨酸殘基都有可能被硝化。ONOO-硝化胰島素的反應與pH 值密切相關，在生理pH 值條件下，ONOO-的硝化作用最強。CO2 對胰島素的硝化具有催化作用。乙二胺四乙酸鐵配合物可催化胰島素硝化，而二乙三胺五乙酸鐵配合物對胰島素硝化無影響。白蛋白對胰島素的硝化具有競爭抑制作用

4、，但在高濃度的白蛋白存在時，胰島素依然可以被硝化。 ⑵采用高效液相色譜分離制備得到了胰島素的單硝化和二硝化組分。運用凝膠電泳、高效液相色譜和質譜等技術，結合A、B 鏈拆分和V8 蛋白酶酶解方法，對硝化胰島素的硝化位點進行了分析。還原條件下硝化組分的常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳以及色譜分離出的單硝化胰島素A 鏈的質譜結果表明胰島素的A 鏈優(yōu)先B 鏈被硝化。V8 蛋白酶酶切單硝化胰島素后的質譜結果表明單硝化胰島素的硝化位點是Tyr-A14

5、。結合電泳的結果和晶體結構分析，Tyr-A19 較B 鏈上的Tyr 殘基更容易硝化，而Tyr-B26 可能較Tyr-B16 更容易硝化。 ⑶運用光譜學方法研究了硝化對胰島素二級結構的影響。綜合熒光光譜、圓二色光譜和傅立葉變換紅外光譜的測試結果，發(fā)現(xiàn)單硝化和二硝化胰島素與胰島素相比α-螺旋的含量下降，A 鏈的硝化可能使A(12-17)的310 螺旋肽段逐漸向不規(guī)則螺旋和無規(guī)結構方向變化，但對胰島素與受體結合面的影響不大。同時硝基的

6、引入使得單硝化和二硝化硝化胰島素趨向于聚集，而二硝化胰島素中Tyr-A19 的硝化可能會改變胰島素與受體的結合面疏水區(qū)的疏水性質。 采用循環(huán)伏安法研究了Tyr、NT 以及Tyr、NT 與白蛋白相互作用后的伏安行為，結果表明硝基的引入將會改變酚羥基氫鍵的作用方式，影響Tyr 與白蛋白的相互作用，這從一個側面反映了硝化可能會影響胰島素與受體的結合。 ⑷測定了單硝化胰島素的生物活力，并對硝化胰島素刺激胰島素受體磷酸化進行了初步

7、的討論。單硝化胰島素的受體結合能力約為胰島素的70％，動物實驗與此結果相一致。 ⑸采用紫外可見光譜測定胰島素與ONOO-反應后NT 產量的變化，研究了谷胱甘肽(GSH)和Ebselen 等抗氧化劑對ONOO-硝化胰島素的影響，并采用高效液相色譜和質譜等手段對GSH 和Ebselen 之間相互作用及其對ONOO-硝化胰島素的影響機理進行了分析。結果表明，油酸和花生四烯酸對胰島素的硝化具有很強的抑制作用，不飽和脂肪酸的抑制作用隨其不