攜帶rIL-10復(fù)制缺陷型重組腺病毒rMSC的構(gòu)建.pdf

1、膿毒癥是一個(gè)世界范圍內(nèi)的醫(yī)學(xué)難題，其發(fā)病率不斷上升，死亡率高居不下。它是一個(gè)涉及大量局部和全身性炎癥反應(yīng)以及凝血溶血等系統(tǒng)的復(fù)雜病理綜合征，其發(fā)病亦涉及諸多環(huán)節(jié)和機(jī)制。以往針對(duì)膿毒癥有諸多治療方法，但效果不盡人意。因此，必須尋找一種更理想的治療手段。 目前，有關(guān)細(xì)胞因子的基因治療已成為研究熱點(diǎn)之一。膿毒癥中炎癥因子發(fā)生的平衡紊亂使得以其為靶點(diǎn)的膿毒癥治療成為一種更具有吸引力的治療策略。研究顯示，IL-10是一種強(qiáng)有力的抗炎因子，

2、并通過多種途徑發(fā)揮抗炎作用。感染時(shí)過度表達(dá)的炎癥細(xì)胞因子在機(jī)體炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的決定性作用。IL-10的這種能夠抑制炎癥細(xì)胞因子的特性使其在膿毒癥、ARDS、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和炎癥性腸病等炎性疾病中的應(yīng)用成為可能，并在抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)疾病轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮了重要作用。因此，我們亦選擇IL-10作為本研究的靶基因，進(jìn)行針對(duì)膿毒癥基因治療的動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。另外，MSC具有取材方便、多向分化潛能、可植入性以及便于外源基因的轉(zhuǎn)染和調(diào)控等優(yōu)勢(shì)而

3、成為目前許多基因治療研究所選用的細(xì)胞載體，也為本研究所選用。與以重組腺病毒直接回輸體內(nèi)相比，MSC作為載體可增加組織特異性、減少宿主免疫反應(yīng)并延長(zhǎng)目的基因的表達(dá)時(shí)間。 本研究中，我們利用具有高轉(zhuǎn)染率的腺病毒介導(dǎo)靶基因rIL-10至rMSC中，隨后檢測(cè)rMSC中外源基因的表達(dá)情況，為后續(xù)的動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。目的： 1構(gòu)建載有大鼠白細(xì)胞介素10(ratinterleukine-10，rIL-10)重組腺病毒的大鼠骨髓間充

4、質(zhì)干細(xì)胞(bonemesenchymalstemcellofrat，rMSC)并觀察外源基因在細(xì)胞中的表達(dá)情況。 2為后續(xù)的動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)，以探討含有rIL-10的rMSCs對(duì)膿毒癥的影響。 方法1采用RT-PCR的方法從健康SD大鼠新鮮脾臟組織中提取出的總RNA中克隆rIL-10基因，于HindⅢ/SalⅠ位點(diǎn)亞克隆入腺病毒穿梭載體成為pAdTrack-CMV.rIL-10；PmeⅠ將其線性化后與腺病毒基因組載體

5、pAdEasy-1共轉(zhuǎn)染E.coliBJ5183而同源重組為pAd.rIL-10；再經(jīng)PacⅠ酶切后轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞進(jìn)行重組腺病毒的包裝，利用Westernblotting和RT-PCR的方法鑒定。經(jīng)反復(fù)感染HEK-293對(duì)重組腺病毒進(jìn)行大規(guī)模擴(kuò)增純化后，獲得的病毒滴度為6.0×1010pfu/mL。 2無菌操作下取健康SD大鼠脛骨和腓骨骨干，獲得骨髓細(xì)胞。利用密度梯度離心法和貼壁法二者結(jié)合來分離并體外培養(yǎng)擴(kuò)增大鼠骨髓間充

6、質(zhì)干細(xì)胞(rMSC)，培養(yǎng)至多代并使用流式細(xì)胞儀對(duì)第三代rMSC進(jìn)行表型等鑒定。將重組腺病毒感染rMSC并同時(shí)做好對(duì)照組。細(xì)胞分組如下：實(shí)驗(yàn)組使用含rIL-10重組腺病毒(Ad.IL-10)感染rMSC(loadedrMSC/rIL-10+)；對(duì)照組使用不含rIL-10的重組腺病毒(Ad.GFP)感染rMSC(loadedrMSC/rIL-10-)。用不同的感染倍數(shù)(multipleofinfection，m.o.i)的Ad.rIL-1

7、0/Ad.GFP感染rMSC，在熒光顯微鏡下觀察感染效率，并用ELISA、RT-PCR和Weaternblot方法檢測(cè)外源基因rIL-10在rMSC中的表達(dá)情況。 結(jié)果1采用RT-PCR方法從健康SD大鼠新鮮脾臟組織中提取的總RNA中成功地克隆出rIL-10基因，構(gòu)建了重組腺病毒Ad.rIL-10，Westernblotting和RT-PCR證實(shí)構(gòu)建成功。大規(guī)模擴(kuò)增并濃縮后，計(jì)算病毒滴度為6.0×1010pfu/mL。

8、2采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁法原代培養(yǎng)并于體外擴(kuò)增出rMSCs，高表達(dá)CD29，CD105和CD166，不表達(dá)CD45。 3重組腺病毒Ad.rIL-10對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有較高的轉(zhuǎn)染效率，當(dāng)MOI200時(shí)為70％。用ELISA的方法檢測(cè)上清中rIL-10的含量高達(dá)(136.2±15.62)ng/mL并維持于較高水平兩周以上。 4重組腺病毒感染的rMSC可持續(xù)高效表達(dá)外源基因rIL-10。rIL-10可通過細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)而發(fā)

9、揮其生物學(xué)作用。 結(jié)論1采用RT-PCR方法從健康SD大鼠新鮮脾臟組織中提取出的總RNA中克隆rIL-10基因，構(gòu)建出重組腺病毒Ad.rIL-10。經(jīng)擴(kuò)增純化獲得病毒滴度為6.0×1010pfu/mL足以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 2聯(lián)合使用密度梯度離心法和貼壁法進(jìn)行原代培養(yǎng)并于體外擴(kuò)增出rMSCs，高表達(dá)CD29，CD105和CD166，不表達(dá)CD45。方法簡(jiǎn)便易行，穩(wěn)定可靠，產(chǎn)量和質(zhì)量均能夠滿足實(shí)驗(yàn)的需要。 3重組腺病毒