人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7基因強(qiáng)化的組織工程骨的構(gòu)建及對(duì)兔骨缺損修復(fù)作用研究.pdf

1、目的：創(chuàng)傷、感染、腫瘤、先天性疾病等原因所致的骨缺損臨床常見(jiàn)。組織工程骨兼有骨誘導(dǎo)性和骨傳導(dǎo)性，且可根據(jù)需要制成不同的形狀，為臨床治療大段骨缺損帶來(lái)希望。但是組織工程研究中，細(xì)胞因子無(wú)論是從天然生物中提純，還是用基因工程表達(dá)，均存在程序復(fù)雜，產(chǎn)量低，活性不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，因此如何有效發(fā)揮細(xì)胞生長(zhǎng)因子適時(shí)、適量效用，利用細(xì)胞與基質(zhì)材料特異性黏附，細(xì)胞增殖，定向分化，發(fā)揮正常的生理功能，以實(shí)現(xiàn)最終理想的功能替代，一直是組織工程研究的難點(diǎn)與熱點(diǎn)，

2、基因工程技術(shù)與組織工程的結(jié)合為以上問(wèn)題的解決提供了可供選擇的良好辦法。 目前BMP-7重組蛋白及醫(yī)用硫酸鈣已商品化。本實(shí)驗(yàn)以醫(yī)用硫酸鈣為支架材料，轉(zhuǎn)染人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(BMP-7)基因的骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)作為種子細(xì)胞，體外構(gòu)建基因強(qiáng)化的組織工程骨，并研究該組織工程骨對(duì)骨缺損的治療作用。希望能為骨缺損的治療提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。 方法： 1.BMP-7基因重組腺病毒載體(Ad.BMP-7)的構(gòu)建抽提人胎腎

3、組織總mRNA，經(jīng)RT-PCR合成rBMP-7基因，繼而再將其插入帶有腺病毒基因組的、擴(kuò)增后挑選插入方向正確的克隆。在脂質(zhì)體介導(dǎo)下，用攜帶目的基因的粘粒載體pAxcAwt.BMP-7與腺病毒基因組末端蛋白DNA-TPC共同轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，制備重組腺病毒。通過(guò)對(duì)重組腺病毒DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)及酶切鑒定，將鑒定好的病毒克隆進(jìn)一步擴(kuò)增、純化和測(cè)定滴度。 2.髓基質(zhì)細(xì)胞體外的分離、培養(yǎng)以及Ad.BMP-7體外轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細(xì)胞后的表達(dá)采用

4、密度梯度離心法與貼壁篩選法聯(lián)合體外分離、培養(yǎng)兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)，觀察原代及傳代細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育情況，并繪制生長(zhǎng)曲線。Ad.BMP-7轉(zhuǎn)染BMSCs，使用熒光顯微鏡和免疫組化方法檢測(cè)BMP-7蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)。 3.體外構(gòu)建BMP-7基因強(qiáng)化的組織工程骨將第三代骨髓基質(zhì)細(xì)胞和轉(zhuǎn)染BMP-7基因的骨髓基質(zhì)細(xì)胞分別與硫酸鈣材料在體外復(fù)合培養(yǎng)，通過(guò)消化法、倒置相差顯微鏡和掃描電鏡觀察細(xì)胞在材料上的黏附情況，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

5、 4.基因強(qiáng)化的組織工程骨對(duì)骨缺損修復(fù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)60只新西蘭大白兔隨機(jī)分為A、B和C三組，每組20例。A組在骨缺損處植入BMP-7基因+BMSCs+醫(yī)用硫酸鈣材料，B組在骨缺損處植入BMSCs+醫(yī)用硫酸鈣材料，C組單純植入醫(yī)用硫酸鈣。分別在術(shù)后4、8和12周取材，通過(guò)大體觀察、影像學(xué)、組織學(xué)和生物力學(xué)等方法觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物骨缺損的修復(fù)情況。 結(jié)果： 1.提取的RNA完整，純度高。RT-PCR合成的DNA片段經(jīng)克隆、測(cè)序

6、后確證為目的基因(BMP-7基因)，插入粘粒載體pAxCAwt后獲得高滴度重組腺病毒(108pfu/ml)。 2.培養(yǎng)獲得了高純度的兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)。骨髓基質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染Ad.aBMP-7后72小時(shí)熒光顯微鏡可見(jiàn)綠色熒光蛋白表達(dá)，細(xì)胞免疫組化結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)有BMP-7蛋白的表達(dá)。 3.骨髓基質(zhì)細(xì)胞及轉(zhuǎn)染BMP-7基因的骨髓基質(zhì)細(xì)胞在硫酸鈣表面均有生長(zhǎng)，且隨著復(fù)合培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，材料上細(xì)胞的數(shù)量也隨之增長(zhǎng)。

7、 4.影像學(xué)、病理學(xué)及生物力學(xué)檢測(cè)結(jié)果：BMP-7基因修飾的組織工程骨在植入動(dòng)物骨缺損區(qū)后，能更快地修復(fù)骨缺損。 結(jié)論： 1.DNA末端蛋白復(fù)合物可使重組腺病毒的制備效率大大提高，降低野生型腺病毒出現(xiàn)的概率。重組腺病毒滴度高、純度好、毒性低。 2.我們構(gòu)建的攜帶BMP-7基因的腺病毒載體，能高效轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞。后者能夠表達(dá)、分泌BMP-7蛋白。 3.成功構(gòu)建BMP-7基因強(qiáng)化的組織工程骨。