大劑量甲潑尼松龍對大鼠液壓沖擊傷性腦水腫AQP4表達的影響.pdf

1、第一部分不同分級液壓沖擊腦損傷模型的建立及病理學觀察
　　 目的:建立不同分級液壓沖擊腦損傷動物模型,觀察、比較其病理學變化。
　　 方法:
　　 1 實驗分組及模型建立:成年、清潔級、雄性SD大鼠160只(由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供),隨機分為空白對照組(8只)、假手術組(8只)、損傷組(144只)。①損傷組:按0.1mpa、0.2mpa、0.3mpa三種不同沖擊壓力分為0.1mpa沖擊傷組、0.2mpa沖

2、擊傷組、0.3mpa沖擊傷組,每組又隨機按傷后1h、6h、12h、24h、3d、7d六個時間點各分為六個亞組,每亞組8只大鼠。按文獻制作液壓沖擊傷動物模型。③空白對照組為正常大鼠,僅予以麻醉。④假手術組大鼠只做開顱手術,不給于液壓沖擊。除③④組大鼠24h處死取材外,其余各組于對應時間點處死大鼠取材。
　　 2 實驗指標的觀察:①腦組織承受沖擊壓力的檢測:利用壓力傳感器對0.1mpa、0.2mpa、0.3mpa三個不同沖擊壓力作用

3、大鼠腦損傷部位的最后壓力進行檢測,同時利用計算機進行數據采集。②神經行為學的觀察:以大鼠骨窗內硬膜發(fā)藍、出現短暫的呼吸暫停或一側肢體的偏癱作為TBI模型制作成功的標準。以大鼠神經功能行為學評分表為標準,評價各組動物神經功能及行為學變化。③腦含水量:采用干濕比重法測量各組不同時間點的腦含水量。④病理學觀察:應用光鏡觀察各組動物損傷腦組織的病理學改變,比較其演變趨勢。以上結果所得數據采用均數±標準差(-X±s)表示,利用spss13.0統(tǒng)計

4、軟件進行統(tǒng)計分析,采用單因數方差分析和X2檢驗,以p＜0.05認為有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 1 沖擊壓力的檢測:同一沖擊壓力下各亞組實測壓力值之間無統(tǒng)計學差異,不同液壓沖擊傷組之間的實測壓力值有統(tǒng)計學意義。
　　 2 神經行為學變化:隨著沖擊壓力增強,損傷各組大鼠出現不同程度呼吸功能障礙:0.1mpa沖擊傷組大鼠出現一過性的呼吸減弱,0.2mpa沖擊傷組大鼠呼吸暫停時間10.88±2.69s,0.3mp

5、a大鼠呼吸暫停時間20.60±3.02s。沖擊傷組大鼠死亡率隨著沖擊力的增加而升高,0.1 mpa、0.2mpa、0.3mpa組分別為2.08％、4.17％、16.67％,均在沖擊傷后15min內死亡,死亡原因多見于腦干損傷和急性肺水腫。
　　 3 神經功能評分:各沖擊傷組1h神經功能評分比正常對照組下降,并持續(xù)到24h,其中,0.1mpa沖擊傷組神經功能評分恢復較快,在24h已與對照組無顯著差異。0.2mpa沖擊傷組傷后各時間

6、點的神經功能評分均明顯減少。而0.3mpa沖擊傷組傷后不僅各時間點的神經功能評分明顯減少,而且恢復較慢,7d仍低于對照組,且與0.1mpa沖擊傷組、0.2mpa沖擊傷組相比較有統(tǒng)計學意義。
　　 4 腦含水量變化:0.1 mpa沖擊傷組腦含水量在術后1 h開始增加,6h明顯加重,24h出現高峰,達81.12±0.03％,3d后下降,逐漸趨于正常。0.2mpa沖擊傷組腦含水量1h已明顯增加,6h即升高至79.48±1.54％,并持

7、續(xù)到24h,3d開始下降,但與正常對照組相比仍然差異顯著;0.3mpa沖擊傷組增加最為明顯:1h即高達79.16±0.02％,6到12h持續(xù)增加,12h高達81.82±0.06％,持續(xù)到3d,7d逐漸趨于正常,與正常對照組比,仍有統(tǒng)計學意義。
　　 5 組織學觀察:隨著沖擊壓力的增強,腦損傷程度逐漸加重、腦損傷范圍加大,硬膜外和硬膜下出血的范圍亦逐漸擴大,而且腦水腫出現越來越早,而神經膠質細胞氣球樣變以及神經元出現細胞核固縮、壞

8、死、數目減少等變化出現時間提前、程度和范圍加大,同時伴有大量炎細胞浸潤和紅細胞的滲出。
　　 結論:輕、中、重三種不同損傷程度的腦損傷模型能夠復制,具有質量穩(wěn)定且與人類腦損傷后病理變化相似的特點。
　　 第二部分大劑量甲潑尼松龍對大鼠液壓沖擊中度腦損傷腦水腫AQP4表達的影響
　　 目的:應用第一部分建立的中度液壓沖擊腦損傷模型,予以大劑量MP實施干預,來觀察大劑量NIP對腦水腫和AQP4表達的影響,為臨床應用甲

9、潑尼松龍治療腦水腫提供理論支持。
　　 方法:
　　 1 實驗分組及模型建立:成年清潔級雄性SD大鼠104只,隨機分為正常對照組(4只)、假手術組(4只)、損傷組(48只)和干預組(48只)。后兩組按傷后1h、6h、12h、24h、3d、7d六個時間點再分為六個亞組,每亞組8只。造模成功后,MP干預組即刻給予尾靜脈注射甲潑尼松龍:首次按30mg/kg,以后按5.4mg/kg給藥,每6h一次,直到3d,第4～7d改為10m

10、g/kg。損傷組則在對應時間點予以等量生理鹽水。假手術組大鼠只做開顱手術,不給予液壓沖擊。除對照組于術后24h處死取材,各組于傷后1h、6h、12h、24h、3d、7d六個時間點處死大鼠取材。
　　 2 實驗指標的觀察:①腦含水量:采用干濕比重法測量腦含水量。②神經功能評分:以大鼠神經功能行為學評分表為標準,評價各組動物神經功能及行為學變化。③AQP4蛋白表達:采用免疫組化和免疫蛋白印跡(Western blot)法測量各組不同

11、時間點AQP4蛋白的表達變化。(4)AQP4mRNA表達:采用逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)法測量AQP4mRNA的表達變化。
　　 3 統(tǒng)計學分析:結果所得數據均采用均數±標準差(-X±s)表示,采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對結果進行統(tǒng)計處理,組內樣本均數間比較采用單因素方差分析,組間樣本均數比較采用獨立樣本t檢驗,以p＜0.05認為有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 1 病理變化:與對照組相比較,MP干

12、預組光鏡下可見膠質細胞呈氣球樣變的程度明顯減輕,而且擴大的血管外間隙也明顯縮小。
　　 2 腦含水量的變化:與對照組相比較,腦含水量傷后1h開始升高,6h和12h逐漸上升,24h達最大值(82.74±1.11％),3d開始下降、7d逐漸接近正常。與損傷組比較,MP能顯著降低干預組6h、12h、24h、3d(77.71±1.15％,78.18±1.36％,80.11±0.84％,79.95±0.85％)四個時間點腦含水量、差異有統(tǒng)

13、計學意義(p＜0.05),而1h和7d兩個時間點,腦含水量減少無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。
　　 3 AQP4蛋白表達的變化:與對照組相比較,腦損傷后AQP4表達1h開始升高,6h和12h逐漸上升,24h(免疫組化0.126±0.018,Western-blot1.168±0.165,p＜0.05)達最大值,3d開始下降、7d逐漸接近正常。與損傷組比較,干預組6h、12h、24h、3d(免疫組化0.062±0.029,0.07

14、9±0.010,0.098±0.016,0.080±0.021;Western blot0.511±0.131,0.571±0.111,0.832±0.123,0.752±0.918)四個時間點AQP4蛋白表達顯著下降、差異有統(tǒng)計學意義,而1h和7d兩個時間點,AQP
　　 4 蛋白的表達量減少無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。
　　 5 AQP4mRNA表達的變化:與對照組相比較,腦損傷后AQP4mRNA表達1h開始升高,

15、6h和12h逐漸上升、24h(0.885±0.110,p＜0.05)達最大值,3d開始下降、7d逐漸接近正常。與損傷組比較,干預組6h、12h、24h、3d(0.519±0.106,0.598±0.112,0.665±0.121,0.636±0.103)四個時間點aQp4mRNA表達顯著下降、差異有統(tǒng)計學意義,而1h和7d兩個時間點,AQP4mRNA的表達量減少無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。
　　 結論:
　　 1 大鼠