哮喘小鼠氣道上皮TSLP表達及激活DCs加重氣道炎癥的研究.pdf

1、目的：
　　 支氣管哮喘是一種氣道慢性炎性疾病，本質(zhì)上是一種由多種炎癥細胞、炎性介質(zhì)和細胞因子網(wǎng)絡共同參與的慢性氣道變應性炎癥，以嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞浸潤為特征。支氣管哮喘的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，嚴重威脅著公眾健康，其主要病因和發(fā)病機制尚不明確，是目前研究的熱點。一般認為在遺傳易感人群中，由正常環(huán)境變應原引起的不適當免疫應答，導致哮喘氣道炎癥的發(fā)生與發(fā)展。
　　 傳統(tǒng)認為氣道上皮僅僅是構(gòu)成氣道內(nèi)外環(huán)境的生理

2、屏障，通過其粘液纖毛系統(tǒng)和機械屏障作用在氣道防御中起重要作用。近年來隨著對哮喘發(fā)病機制的深入研究，發(fā)現(xiàn)氣道上皮不僅是氣道的物理屏障，而且在氣道固有免疫和獲得性免疫反應的起始、維持和調(diào)節(jié)中起著重要作用。哮喘發(fā)病過程中，內(nèi)、外源性因素（生物、物理、化學及變態(tài)反應等）反復刺激哮喘患者氣道上皮，引起上皮損傷，釋放一系列的炎癥介質(zhì)、細胞因子和趨化因子等，參與哮喘慢性氣道炎癥的啟動、持續(xù)和氣道重塑過程，并與哮喘的病理生理表現(xiàn)如氣道阻塞和氣道高反應性

3、密切相關(guān)。
　　 近年來，研究發(fā)現(xiàn)TSLP(Thymic stromal lyinphopoietin，胸腺間質(zhì)淋巴細胞生成素)是一種氣道上皮分泌的細胞因子，以特有方式激活DC，并誘導CD4+T細胞向Th2分化發(fā)育，是過敏性炎癥發(fā)生的一種主要啟動因子，在過敏性疾病發(fā)生中起重要作用。大量研究證實，TSLP在哮喘患者氣道中表達增加，而且TSLP的表達量與聚集Th2的化學因子以及病情的嚴重程度相關(guān)，TSLP促使Th0細胞向Th2細胞分

4、化，導致Th2炎癥因子釋放增加，加重氣道炎癥，在哮喘發(fā)病中有重要意義。我們試圖通過建立小鼠哮喘模型，觀察氣道上皮TSLP在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的表達，探討TSLP在哮喘發(fā)病中的作用及加重哮喘氣道炎癥的機制，從而更加深入明確哮喘的病因和發(fā)病機制。
　　 方法：
　　 雌性BALB/c小鼠30只，隨機分為生理鹽水對照組、哮喘模型組和TSLP抗體干預組，每組10只。用卵白蛋白(OVA)致敏與激發(fā)建立小鼠哮喘模型；測定小鼠的氣道反應性

5、；蘇木素伊紅(HE)染色觀察小鼠肺組織病理變化；收集小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測對照組和哮喘組小鼠BALF上清中IL-4、IL-5和IL-13的含量；實時定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(qRT-PCR)法測定肺組織TSLPmRNA的表達；免疫組化及免疫印跡(Westernblot)法測定肺組織中TSLP蛋白的表達；流式細胞術(shù)檢測BALF中樹突狀細胞(DCs)表面CD40、CD80、CD86的表達。TSL

6、P抗體干預組，進一步采用流式細胞術(shù)檢測BALF中DCs表面CD40、CD80、CD86的表達，ELISA法測定BALF上清中IL-4、IL-5和IL-13的含量。
　　 統(tǒng)計學分析：所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（(?)±s）表示，采用SPSS13.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05表示有統(tǒng)計學意義，P＜0.01表示有顯著統(tǒng)計學意義。免疫組化圖片采用Image-prol-plus軟件分

7、析。
　　 結(jié)果：
　　 1.小鼠造模成功的臨床表現(xiàn)；
　　 以小鼠出現(xiàn)明顯的煩躁不安，活動頻繁，呼吸急促，腹肌抽搐，大、小便失禁，毛發(fā)豎起，部分小鼠出現(xiàn)反應遲鈍，動作遲緩等為誘喘成功的標志。
　　 2.小鼠氣道反應性的測定；
　　 對照組與OVA組小鼠呼氣阻力基礎(chǔ)值之間無差異，注射乙酰甲膽堿(mAch)激發(fā)后，OVA組小鼠呼氣阻力較對照組明顯增高(P＜0.05)，表明哮喘小鼠的氣道反應性顯著高于

8、對照組小鼠，哮喘模型制備成功。
　　 3.HE染色觀察小鼠氣管和肺組織病理學改變；
　　 對照組小鼠氣道上皮結(jié)構(gòu)完整，粘膜下少量炎癥細胞浸潤；OVA組小鼠氣道上皮脫落，粘膜下大量炎性細胞浸潤和腺體增生。對照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁結(jié)構(gòu)完整，氣道周圍少量炎癥細胞浸潤；OVA組支氣管上皮脫落，肺泡壁明顯增厚，血管及支氣管周圍以嗜酸性粒細胞為主的大量炎性細胞浸潤。
　　 4.免疫組化檢測肺組織內(nèi)TSLP的表達水平；

9、r>　　 對照組可見TSLP表達較弱，支氣管上皮僅見少量表達；OVA組可見支氣管上皮及肺泡上皮上存在大量被染成褐色TSLP陽性免疫反應，表達明顯強于對照組。
　　 5.小鼠BALF上清中IL-4、IL-5和IL-13的表達水平；
　　 與對照組相比，OVA組BALF上清中IL-4、IL-5和IL-13的表達水平明顯增高，兩組間差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 6.TSLPmRNA在肺組織的表達水平；<

10、br>　　 OVA組肺組織中TSLPmRNA表達強度較對照組顯著增強，兩組間差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 7.肺組織中TSLP蛋白的表達水平；
　　 OVA組肺組織中TSLP蛋白的表達水平較對照組顯著增強，兩組間差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 8.BALF中DCs表面CD40、CD80、CD86分子的表達水平；
　　 與對照組相比，OVA組BALF中DCs表面CD40、CD80

11、和CD86分子表達增強，兩組間差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 9.TSLPmRNA表達強度與BALF中IL-4、IL-5和IL-13水平相關(guān)性分析；
　　 OVA組TSLPmRNA的表達與BALF中IL-4、IL-5和IL-13的水平均明顯升高，直線相關(guān)Pearson分析，TSLP和IL-4呈正相關(guān)(r=0.989，p＜0.01)，TSLP和IL-5呈正相關(guān)(r=0.996，p＜0.01)，TSLP和IL-1

12、3呈正相關(guān)(r=0.998，p＜0.01)。
　　 10.TSLP抗體干預的作用；
　　 TSLP抗體干預組，肺組織中TSLPmRNA的表達較OVA組降低，但與對照組相比無差異(P＞0.05)； BALF中DCs表面CD40、CD80、CD86分子的表達較OVA組降低，但與對照組相比無差異(P＞0.05)，進一步檢測BALF上清中IL-4、IL-5和IL-13的水平，發(fā)現(xiàn)IL-4、IL-5和IL-13的表達水平較OVA組