雞豆黃素A通過雌激素受體抑制BV2細胞的激活及其對MPP+誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡的保護作用.pdf

1、帕金森?。╬arkinson' disease，PD）是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，嚴重威脅了中老年人的生命健康。黑質(zhì)致密部多巴胺（dopamine，DA）能神經(jīng)元凋亡是PD的主要特征，目前PD病因尚不明確，臨床上也無有效治愈手段。有研究表明小膠質(zhì)細胞活化介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥與PD的病程進展有關(guān)，雌激素替代療法在治療PD中顯示出了良好的前景。雞豆黃素A（biochanin A，Bioch A)是一種異黃酮類植物雌激素，可以與雌激素受體（estr

2、ogen receptors，ERs）結(jié)合發(fā)揮類雌激素樣作用，我們先前研究表明Bioch A可以抑制小膠質(zhì)細胞的激活，但對于它在PD等神經(jīng)退行性疾病的作用尚不明確。
　　目的：研究Bioch A能否通過ERs抑制LPS誘導(dǎo)的BV2細胞激活模型及其對MPP+誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡模型是否具有保護作用。
　　方法：
　　1.將常規(guī)培養(yǎng)的BV2細胞分成7組：（1）Control組；（2）LPS（10μg/ml）組；（3）Bi

3、och A(5μM)組；（4）Bioch A(5μM)+ICI（0.1μM）組；（5）ER(0.1μM）組；（6）ER(0.1μM）+ICI（0.1μM）組，(7)ICI組（0.1μM）組。分別加入以上藥物預(yù)處理2h，除Control組外其余各組均加入LPS（10μg/ml）共同孵育36h。采用Griess法檢測上清液中的一氧化氮（nitric oxide，NO)含量；采用DCFH-DA探針法測量細胞內(nèi)的活性氧（reactive oxy

4、gen species，ROS）的含量；采用ELISA法檢測細胞上清液中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-1β（interleukin1β，IL-1β）和前列腺素E2（prostaglandin，PGE2）的含量；采用蛋白免疫印跡法（western blot）分別檢測了尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶（NADPH oxidase)的亞基P47phox和gp91phox，一氧化氮合成酶（i

5、nducible nitric oxide synthase，iNOS)，NF-κB和p-NF-κB，以及增設(shè)了MAPK通路特異性抑制劑組PD098059（0.02μM，ERK抑制劑)、SP600125（0.01μM，JNK抑制劑）、SB203580（0.02μM，P38抑制劑）的p-ERK、p-JNK和p-P38的蛋白表達。
　　2.用MTT法檢測MPP+對PC12細胞的凋亡毒性作用和Bioch A的合適藥物濃度，篩選出MPP+

6、誘導(dǎo)細胞凋亡的劑量和Bioch A的應(yīng)用劑量。將常規(guī)培養(yǎng)的PC12細胞分成6組。（1）Control組；（2）MPP+（1μM）組；（3）Bioch A（1.25μM）；（4）Bioch A（2.5μM）；（5）Bioch A（5μM）；（6）ER（0.1μM）組。加藥預(yù)處理2h后，除Control組外，其余各組加入MPP+（1μM）共同孵育36h。采用DCFH-DA探針法檢測ROS；利用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞

7、凋亡率；Western blot法檢測cleaved Caspase-3以及cleaved Caspase-9表達水平。
　　結(jié)果：
　　1.與Bioch A組比較，Bioch A+ICI組升高了細胞上清液中NO含量以及細胞內(nèi)ROS表達水平。表明Bioch A通過雌激素受體降低BV2激活后產(chǎn)生的NO含量和ROS表達。
　　2.與Bioch A組比較，Bioch A+ICI組升高了TNF-α、IL-1β和PGE2炎性因子

8、的含量，同時上調(diào) iNOS蛋白表達水平。表明 Bioch A通過雌激素受體抑制 BV2激活發(fā)揮其抗炎作用。
　　3.與Bioch A組比較，Bioch A+ICI組上調(diào)了NADPH氧化酶的亞基P47phox和gp91phox以及p-NF-κB蛋白表達水平。表明Bioch A通過雌激素受體下調(diào)BV2激活后產(chǎn)生的P47phox和gp91phox以及p-NF-κB蛋白表達水平。
　　4.Bioch A組可以明顯降低LPS刺激誘導(dǎo)的

9、p-ERK、p-JNK和p-P38蛋白的表達。與Bioch A組比較，Bioch A+ICI組升高了p-ERK、p-JNK和p-P38蛋白表達水平。表明Bioch A通過雌激素受體抑制BV2激活后產(chǎn)生的MAPK信號通路。
　　5.與Control組相比，MPP+各劑量組細胞存活率隨著劑量的增加而下降，根據(jù)細胞存活率選取1nM作為MPP+造模濃度。與Control組相比，Bioch A(10μM)以上劑量組出現(xiàn)了明顯的活性抑制，因此

10、我們選擇Bioch A（1.25、2.5.、5μM）三個濃度進行實驗。
　　6.MPP+模型組ROS含量較對照組升高明顯，Bioch A（2.5，5μM）組減少了PC12細胞內(nèi) ROS的含量。
　　7.與Control組相比，MPP+模型組細胞凋亡率和活化的cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9蛋白表達提高，Bioch A（2.5，5μM）有效降低了細胞凋亡率以及cleaved Caspase