SNAI2作為ceRNA調控MARCKS表達促進卵巢癌侵襲轉移的分子機制研究.pdf

1、本文從以下四個部分展開了論述：
　　第一部分 SNAI2與卵巢癌臨床病理因素的相關性及其與預后的關系
　　目的:探討SNAI2與卵巢癌臨床病理因素的相關性及其與預后的關系
　　方法:從TCGA數(shù)據(jù)庫提取208例漿液性卵巢癌患者的臨床資料和SNAI2的表達數(shù)據(jù)，卡法檢驗分析SNAI2的表達與年齡、組織學分級、FIGO分期和淋巴管浸潤的相關性;同時提取TCGA數(shù)據(jù)庫208例漿液性卵巢癌患者和GSE26712數(shù)據(jù)集185例漿

2、液性卵巢癌患者的生存資料和SNAI2的表達數(shù)據(jù)，Log-rank分析分析SNAI2的表達與卵巢癌患者總生存期的相關性，Kaplan-Meier法繪制生存曲線圖。
　　結果:SNAI2的表達和患者年齡及卵巢癌組織學分級無明顯相關性;SNAI2在FIGOⅢ-Ⅳ期卵巢癌組織中的表達明顯高于FIGOⅠ-Ⅱ期卵巢癌組織中的表達，且SNAI2高表達的卵巢癌患者更容易發(fā)生淋巴管浸潤。在TCGA數(shù)據(jù)集中，SNAI2高表達的卵巢癌患者總生存期明顯低

3、于SNAI2低表達的卵巢癌患者(P=0.044，HR=0.65)。這一結果在GSE26712數(shù)據(jù)集中得到進一步確認，即SNAI2的表達與卵巢癌患者的總生存期呈明顯負相關(P=0.0017，HR=0.56)。
　　結論:SNAI2高表達是卵巢癌患者預后的一個不良因素。
　　第二部 分SNAI2相關ceRNA的篩選和鑒定
　　目的:SNAI2相關ceRNA的篩選和鑒定
　　方法:生物信息學預測并結合文獻篩選SNAI2

4、相關ceRNA;在OVCA433和SKOV-3細胞中過表達SNAI2-3'UTR，Real-time PCR和Western Blot檢測干擾SNAI2-3'UTR前后候選基因表達水平的改變;選取受SNAI2-3'UTR正向調控的基因，在TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫檢測SNAI2和候選ceRNA在卵巢癌組織中的表達的相關性;Real-time PCR檢測能同時靶向SNAI2和MARCKS的miR-200c，miR-204，miR-211，mi

5、R-218和miR-429在OVCA433和SKOV-3細胞中的相對表達量，選取表達量相對較高的miRNA作為候選miRNA。雙熒光素酶報告基因實驗分析候選miRNA對MARCKS的抑制作用，以及SNAI2-3'UTR是否可以通過競爭性結合候選miRNA誘導MARCKS的表達。
　　結果:生物信息學預測并結合文獻篩選出10個SNAI2相關ceRNA，包括CDH2，F(xiàn)N1,KLF8,MARCKS,MMP2,PPARG TWIST1,

6、VIM,ZEB1和ZEB2。在OVCA433和SKOV-3細胞中過表達SNAI2-3'UTR能顯著促進MARCKS的mRNA和蛋白表達水平。相關性分析進一步發(fā)現(xiàn)，SNAI2和MARCKS在卵巢癌組織中的表達呈明顯正相關。且在SNAI2低表達的卵巢癌組織中，MARCKS也呈低表達，而在SNAI2高表達的卵巢癌組織中，MARCKS也呈高表達。miRNA表達譜分析表明miR-218，miR-200c和miR-429在OVCA433和SKOV-

7、3細胞中的表達量相對較高，miR-204表達相對較低，miR-211基本不表達。我們選取miR-218，miR-200c和miR-429作為候選miRNA。雙熒光素酶報告基因實驗表明:①miR-218和miR-200c通過結合MARCKS-3'UTR種子區(qū)結合序列，顯著抑制熒光素酶的相對活性，而miR-429對熒光素酶抑制作用相對較弱;②SNAI2-3'UTR可以通過競爭性結合miR-218和miR-200c，抑制miR-218和miR

8、-200c的活性，逆轉其對熒光素酶的抑制作用。
　　結論:SNAI2作為ceRNA誘導的MARCKS表達增強至少部分是通過抑制miR-218和miR-200c活性介導的。
　　第三部分 MARCKS在卵巢癌EMT中的功能分析
　　目的:解析MARCKS在卵巢癌EMT中的作用
　　方法:用慢病毒載體介導的shRNA轉染OVCA433和SKOV-3細胞，構建MARCKS穩(wěn)定低表達的穩(wěn)轉細胞株，Real-time PC

9、R和Western Blot檢測MARCKS降表達效率。羅氏實時細胞分析儀RTCA-CIM-Plate檢測MARCKS降表達后，卵巢癌OVCA433和SKOV-3細胞浸潤和遷移能力的改變;同時在顯微鏡下觀測干擾MARCKS表達前后，細胞形態(tài)學的改變。
　　結果:在OVCA433和SKOV-3細胞中轉染MARCKS-shRNA后，MARCKS的mRNA和蛋白水平均明顯下調。功能學研究表明，下調MARCKS的表達能顯著抑制卵巢癌細胞的

10、浸潤和遷移能力，同時細胞的形態(tài)更趨向于上皮細胞。
　　結論:SNAI2促進卵巢癌細胞發(fā)生EMT的功能至少部分是通過ceRNA作用模式，誘導MARCKS表達介導。
　　第四部分 SNAI2-3'UTR在卵巢癌侵襲轉移中的作用研究
　　目的:探討SNAI2-3'UTR在卵巢癌侵襲轉移中的作用。
　　方法:用慢病毒載體在OVCA433和SKOV-3細胞中過表達SNAI2-3'UTR，羅氏實時細胞分析儀RTCA-CIM-