EGFR信號誘導PKM2-β-catenin核轉位促進原發(fā)性肝癌根治性切除術后早期復發(fā).pdf

1、根治性切除是早期肝癌治療最理想的手段，然而仍然有30-50％的患者預后較差，在諸多影響預后的因素中，早期復發(fā)又是其中最重要的因素之一。肝癌的早期復發(fā)是指根治性切除術后一年內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見的肝內(nèi)或肝外轉移灶，而且這種轉移灶的惡性程度較高，因此，預防早期復發(fā)是改善肝癌根治性切除術患者預后最關鍵的途徑。然而，一方面，臨床上尚無準確預測肝癌根治性切除后早期復發(fā)的指標，另一方面，肝癌根治性切除術后早期復發(fā)(Early Recurrence of H

2、CC after Radical Resection,ERHRR)的分子機制不明，因此，尋找準確預測早期復發(fā)的指標和揭示早期復發(fā)的分子機制迫在眉睫。
　　肝癌根治性切除后早期復發(fā)主要是癌細胞肝內(nèi)或肝外轉移擴散的結果，本課題組對肝癌的轉移機制進行了大量的研究，發(fā)現(xiàn)相關生長因子控制的下游信號通路活化是肝癌惡變的一個重要標志。新近的臨床研究表明EGFR信號在40-70％肝癌患者處于激活狀態(tài)，然而其與ERHRR的關系尚不清楚?？紤]到EGF

3、R信號在肝癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用，我們提出EGFR信號的激活可能是參與ERHRR的分子機制之一的科學假說。
　　本論文首先探討了EGFR信號與ERHRR的相關性。以免疫組織化學方法檢測62例原發(fā)性肝癌根治性切除患者新鮮肝癌組織標本中p-EGFR水平，并用Kaplan-Meier分析p-EGFR的表達與早期復發(fā)的相關性。結果發(fā)現(xiàn)，58％的肝癌患者p-EGFR呈陽性表達，統(tǒng)計分析顯示肝癌組織標本中p-EGFR的水平與根治性切除術后早期

4、復發(fā)具有明顯的相關性。體外實驗研究發(fā)現(xiàn)，五種人肝癌細胞株中，HepG2和SMMC-7721中EGFR的表達最高，同樣，二者對EGF刺激的反應也最敏感，EGF(100ng/ml)處理12h后，細胞即出現(xiàn)了明顯的間質化形態(tài)，同時細胞遷移能力明顯增加，提示活化EGFR信號誘導了肝癌細胞的上皮間質化。目前已明確，EMT是肝癌發(fā)生肝內(nèi)轉移必須經(jīng)歷的過程。因此，我們推測EGFR信號誘導的肝癌細胞EMT可能是導致ERHRR的重要機制之一。本論文接下來

5、主要研究:①EGFR信號誘發(fā)ERHRR的分子機制;②嘗試尋找預測EGFR信號上調(diào)的ERHRR的可靠指標。
　　體外機制研究，現(xiàn)已明確，多種生長因子(TGF-β，HGF)均可以誘導肝癌細胞EMT過程，有趣的是，β-catenin均在其中發(fā)揮關鍵的作用。本論文研究發(fā)現(xiàn)，EGF誘導的肝癌細胞EMT過程和運動遷移同樣需要β-catenin的參與，進一步機理研究發(fā)現(xiàn)，β-catenin參與EGF誘導的肝癌細胞EMT和遷移是通過上調(diào)β-cat

6、enin-TCF/LEF轉錄活性，上調(diào)其靶基因Snail來實現(xiàn)的。進一步研究發(fā)現(xiàn)EGF誘導的肝癌細胞β-catenin-TCF/LEF轉錄活化不是Wnt信號通路依賴的，而是PI3K/AKT和ERK信號通路依賴的，深入的研究發(fā)現(xiàn)，在EGF誘導的β-catenin-TCF/LEF轉錄激活的過程中，PI3K/AKT調(diào)控β-catenin入核，而ERK調(diào)控PKM2入核，兩者共同調(diào)控TCF/LEF的轉錄活性。
　　為了進一步驗證體外機制研究

7、的結果，本論文對62例肝癌患者新鮮標本包括E-cadherin，Snail，β-catenin，PKM2相關指標的表達進行了檢測，并采用了相關的統(tǒng)計方法進行了分析。相關性分析發(fā)現(xiàn)，p-EGFR的表達與Snail，核內(nèi)PKM2，核內(nèi)β-catenin的表達呈正相關，而與E-cadherin成負相關。同時還發(fā)現(xiàn)snail的表達水平與核內(nèi)PKM2和β-catenin共同表達水平呈正相關，而E-cadherin的表達水平與核內(nèi)PKM2和β-ca

8、tenin共同表達水平呈負相關。另外，本論文還對E-cadherin，Snail及核內(nèi)PKM2/β-catenin共表達水平與早期復發(fā)率進行了Kaplan-Meier分析。結果發(fā)現(xiàn)E-cadherin和Snai的表達水平與早期復發(fā)無明顯的相關性，而核內(nèi)PKM2/β-catenin共表達水平與早期復發(fā)呈現(xiàn)良好的相關性，p-EGFR陽性表達和核內(nèi)PKM2/β-catenin陽性的患者具有最高的復發(fā)率68.64％。COX多因素分析也證實PKM

9、2/β-catenin核內(nèi)共表達是影響ERHRR獨立的因素。
　　PKM2/β-catenin共表達水平與早期復發(fā)呈現(xiàn)良好的相關性，而其下游指標Snail和E-cadherin的表達水平與早期復發(fā)卻無明顯的相關性。緊接著本論文又對這一似乎矛盾的結論進行了深入的研究。結果發(fā)現(xiàn)，EGFR信號不僅誘導肝癌細胞侵襲，還對肝癌細胞的增殖產(chǎn)生影響。有趣的是，EGFR信號對肝癌細胞增殖的影響與EGFR活化的時間相關，短時間(24h以內(nèi))活化EG

10、FR信號抑制SMMC-7721和HepG2的增殖，機制與細胞周期阻止相關;長時間(72h)活化EGFR信號明顯促進SMMC-7721和HepG2的增殖，其機制與上調(diào)C-myc和CyclinD1表達有關。體內(nèi)EGFR信號是處于持續(xù)性活化狀態(tài)，臨床標本分析也證實，Ki-67的表達不僅與p-EGFR的表達呈正相關，還與PKM2/β-catenin核共表達呈正相關。復發(fā)分析發(fā)現(xiàn)E-cadherin(-)/Ki-67(+)的肝癌根治性切除患者具有

11、很高的復發(fā)率。綜上，EGFR信號持續(xù)的激活促進肝癌細胞侵襲和增殖導致肝癌根治性切除患者的早期復發(fā)。
　　本論文通過體內(nèi)和體外的研究確證了EGFR信號在根治性切除肝癌患者術后早期復發(fā)中的作用，并闡明了其分子機制，為EGFR信號活化的肝癌根治性切除患者的早期復發(fā)提供了可靠的預測指標和防治的治療策略。更重要的是，本論文是課題組“國家自然自然基金”和“博士點基金”項目中的部分研究內(nèi)容，為含丹參類中藥復方預防ERHRR的研究提供了醫(yī)學分子生