胚胎心流出道的形態(tài)發(fā)生與呼吸內胚層發(fā)育偶聯(lián).pdf

1、原腸胚期三胚層胚盤頭端及兩側的半月形生心中胚層構成第一生心區(qū)，形成的原始心管僅為左心室原基。位于原始心管頭端和背側的臟壁中胚層間充質構成第二生心區(qū)，不斷向心管添加心肌細胞，形成流出道、右心室、部分心房等結構，但第一生心區(qū)和第二生心區(qū)在胚胎發(fā)生過程中的形態(tài)學關系，所見報道較少。心肌前體細胞向心肌細胞的分化以及正常心形態(tài)發(fā)生受多種信號系統(tǒng)及轉錄因子的調節(jié)，其中轉錄因子ISL-1是第二生心區(qū)心肌前體細胞較好的標記蛋白，GATA4與NKx2.5

2、是心肌前體細胞和心肌細胞較好的標記蛋白，調控第一和第二生心區(qū)心肌前體細胞的增生及向心肌細胞的分化。GATA4、Nkx2.5和ISL-1基因突變或基因敲除引發(fā)先天性心臟畸形或胚胎死亡。第一、第二生心區(qū)心肌前體細胞向心肌細胞的分化及心的正常形態(tài)發(fā)生需內胚層的誘導。在發(fā)育早期去除內胚層，不能形成正常搏動的心管。有關前腸內胚層對心管發(fā)育的誘導作用主要集中在對多種信號分子和轉錄因子的研究，條件性敲除前腸內胚層的一些信號分子或轉錄因子基因，小鼠胚胎

3、流出道、右心室及弓動脈發(fā)育畸形，因此認為，前腸內胚層通過不同的分泌信號分子或轉錄因子作用于心肌前體細胞，誘導心肌細胞分化和心的形態(tài)發(fā)生。有關前腸內胚層發(fā)育與心臟發(fā)育關系的研究主要限于對兩棲類、雞胚的體外觀察及對敲除內胚層相關基因小鼠的觀察，對正常小鼠前腸內胚層在誘導胚胎心肌細胞分化和心發(fā)生過程中的形態(tài)學變化，以及在心形態(tài)發(fā)生過程中與第一、第二生心區(qū)發(fā)育的相互形態(tài)學關系的研究未見報道。本研究探討了第一生心區(qū)和第二生心區(qū)在胚胎發(fā)生過程中的形

4、態(tài)學關系，以及前腸內胚層發(fā)育對小鼠胚胎心流出道的發(fā)生與分隔的影響，為闡明前腸內胚層誘導心正常發(fā)育的理論提供形態(tài)學依據，也為進一步探討由于流出道分隔異常而導致的動脈干永存等先天畸形發(fā)生機制的胚胎學起源提供一定的形態(tài)和理論基礎。
　　 對GATA4在心早期發(fā)育過程中的研究，主要集中在對體外培養(yǎng)或敲基因、轉基因小鼠的表型觀察及mRNA水平，且缺乏系統(tǒng)的報道，對GATA4蛋白在胚胎早期動脈端發(fā)育過程中時空表達規(guī)律以及與Nkx2.5表達的

5、關系也缺乏系統(tǒng)觀察。GATA4可促進前腸內胚層細胞的生長，前腸內胚層可誘導第一、第二生心區(qū)心肌前體細胞的分化和心的正常發(fā)育，對正常小鼠GATA4蛋白在前腸內胚層的時空表達特點及GATA4陽性內胚層與心早期發(fā)育的形態(tài)學關系尚未見報道。本研究應用免疫組織化學結合Westernblotting方法，觀察了GATA4在小鼠胚胎生心區(qū)及前腸內胚層的時空表達特點，探討了GATA4的表達與心動脈端發(fā)育、分隔的關系，為進一步闡明前腸內胚層誘導心正常發(fā)育

6、的理論提供形態(tài)學依據。
　　 本實驗第一部分應用免疫組織化學及免疫熒光方法，結合轉錄因子胰島素增強子結合蛋白(Islet-l，ISL-1)、Nkx2.5、α-平滑肌肌動蛋白（α-smoothmuscleactin，α-SMA）、心肌肌球蛋白重鏈(myosinheavychain，MHC)和增殖細胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen，PCNA)在心肌分化過程中的表達特點，研究了前腸呼吸內胚層的發(fā)

7、育與小鼠胚胎心流出道的形態(tài)發(fā)生關系。第二部分，應用免疫組織化學、免疫熒光和WesternBlotting方法，結合GATA4、Nkx2.5、ISL-1，α-SMA和MHC在小鼠胚胎第一生心區(qū)、第二生心區(qū)及前腸內胚層的時空表達特點，以及GATA4和磷酸化組蛋白H3(PHH3)在胚齡11～14天小鼠胚胎心的表達，探討了轉錄因子GATA4在生心區(qū)及前腸內胚層的表達與小鼠胚胎動脈端發(fā)育的形態(tài)學關系。
　　 第一部分:
　　 小鼠

8、胚胎心流出道的形態(tài)發(fā)生與呼吸內胚層發(fā)育偶聯(lián)
　　 用抗α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、抗心肌肌球蛋白重鏈(MHC)、抗轉錄因子胰島素增強子結合蛋白(ISL-1)、抗Nkx2.5及抗增殖細胞核抗原(PCNA)抗體對胚齡7.5～13天小鼠胚胎心連續(xù)切片進行免疫組織化學PAP法或免疫熒光染色。結果顯示:胚胎發(fā)育7.5天，ISL-1表達于生心板心肌前體細胞和體壁中胚層。隨胚盤側褶形成，ISL-1陽性表達由生心板向胚內體腔內側壁及前腸兩

9、側間充質擴展，發(fā)育為心包腔背側壁及咽兩側ISL-1陽性的第二生心區(qū)間充質，并保持較高的增生活性。胚齡9～10天，MHC表達陽性的心肌延伸至流出道與心背系膜的返折處，與ISL-1、NKx2.5表達重疊。胚胎發(fā)育11天后，ISL-1和α-SMA陽性表達的流出道遠端，失去MHC表達。11天后，前腸腹側ISL-1陽性錐體形結構的頭端、尾端分別延伸至動脈囊頭尾側壁，并伸入動脈囊腔。在胚胎發(fā)育12～13天，錐體形結構的IS1-1陽性心肌前體細胞遷移

10、至心包內升主動脈和肺動脈干壁及主肺動脈隔之間。胚胎發(fā)育第10天始，ISL-1強陽性的前腸腹側呼吸內胚層緊鄰動脈囊背側壁內皮，局部增厚，形成突向動脈囊腔的內胚層突起。發(fā)育至11天后，前腸腹側份ISL-1陽性內胚層增生活躍，上皮細胞層數(shù)明顯增加，并向動脈囊方向生長，形成實心內胚層細胞索。圍繞增生的前腸腹側呼吸內胚層及內胚層細胞索，ISL-1陽性間充質細胞聚集，形成特征性ISL-1陽性錐體形結構。隨發(fā)育，內胚層細胞索伸長，ISL-1陽性錐體形

11、結構的尖端逐漸生長入動脈囊腔，并與流出道心內膜墊融合，將流出道遠端分隔為心包內升主動脈和肺動脈干。胚齡11天，有些部位增厚的內胚層出現(xiàn)細胞排列不規(guī)則，細胞間隙明顯，細胞分散，細胞大小不等，呈現(xiàn)間充質細胞樣形態(tài)，與周圍ISL-1陽性間充質細胞無明確界限。因此，我們認為:ISL-1同時是第一、第二生心區(qū)心肌前體細胞的標記蛋白。第一生心區(qū)和第二生心區(qū)是連續(xù)結構，原始心管的形成與第二生心區(qū)向發(fā)育中心管添加心肌細胞是連續(xù)的發(fā)育過程。第二生心區(qū)IS

12、L-1陽性細胞于胚齡10天前，向心肌細胞分化，11天后，向動脈囊壁平滑肌方向分化。胚齡11天后，前腸腹側ISL-1陽性錐體形結構參與動脈囊壁、主肺動脈隔及心包內升主動脈干和肺動脈干壁的形成。胚齡10天始，前腸腹側呼吸內胚層細胞的增生和細胞索的形成可能誘導第二生心區(qū)的擴展，形成特征性ISL-1陽性錐體形結構。前腸腹側呼吸內胚層細胞在增生過程中失去極性，可能通過上皮一間充質轉化，形成ISL-1陽性錐體形結構中的間充質細胞，保持第二生心區(qū)細胞

13、數(shù)量穩(wěn)定，流出道的分隔和前腸呼吸內胚層的發(fā)育密切相關。
　　 第二部分:
　　 轉錄因子GATA4的表達與小鼠胚胎心動脈端的發(fā)育
　　 用抗GATA4、抗Nkx2.5、抗轉錄因子胰島素增強子結合蛋白(ISL-1)、抗α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和抗心肌肌球蛋白重鏈(MHC)抗體對胚齡7.5～13天小鼠胚胎心臟連續(xù)切片進行免疫組織化學PAP法或免疫熒光染色。WesternBlotting檢測GATA4與磷酸化組

14、蛋白H3(PHH3)在胚齡11～14天小鼠胚胎心的表達。結果顯示:GATA4和Nkx2.5蛋白在小鼠胚胎7.5天同時表達于生心板，早于MHC的表達，胚齡8.5～10天，GATA4和Nkx2.5進一步表達于心包腔背側壁第二生心區(qū)的臟壁中胚層，胚齡11天～l3天，兩者的表達從流出道與心包腔背側壁交界處降至主肺動脈根部，流出道心內膜（墊）間充質中可見GATA4陽性細胞。胚齡11～13天，GATA4見于前腸內胚層，ISL-1陽性間充質細胞圍繞前

15、腸腹側GATA4陽性的呼吸內胚層及內胚層細胞索分布，可見少量GATA4陽性細胞延伸至前腸內胚層周圍的間充質中。GATA4與磷酸化組蛋白H3(PHH3)的表達高峰見于胚齡11～13天，胚齡14天GATA4與PHH3顯著減少。因此，我們認為:小鼠胚胎發(fā)育早期，GATA4與Nkx2.5在生心區(qū)的表達模式相同，GATA4可能促進心肌細胞增生，前腸內胚層的GATA4可能參與第二生心區(qū)的發(fā)育。GATA4在小鼠胚胎心發(fā)育過程中有獨特的時空分布，GAT