深度測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于男男同性戀HIV-1感染者輔助受體基因型的研究.pdf

1、目的：
　　人免疫缺陷病毒1型(Human Immunodeficiency Virus，HIV-1)感染靶細(xì)胞除需要結(jié)合靶細(xì)胞上的CD4分子，還需要輔助受體的參與。CCR5和CXCR4是HIV-1最常利用的輔助受體。
　　國(guó)外的研究認(rèn)為HIV-1在感染早期的無(wú)癥狀階段主要利用CCR5輔助受體。但在急性感染者中，CXCR4和CXCR4/CCR5雙嗜性毒株也存在，有報(bào)道其存在頻率大約為3.17-17.2％。而且，HIV-1對(duì)輔

2、助受體的利用和轉(zhuǎn)化與病毒基因亞型的有關(guān)，不同亞型HIV-1感染的不同階段對(duì)CXCR4的利用的頻率存在明顯差異。
　　病毒利用CXCR4輔助受體不僅與疾病進(jìn)程加速和進(jìn)入AIDS期有關(guān)，也預(yù)示著對(duì)HAART治療的反應(yīng)較差。因此，檢測(cè)輔助受體的類型對(duì)臨床預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展和制定用藥方案都是極其重要的。特別是隨著CCR5拮抗劑Maraviroc逐漸應(yīng)用于臨床早期抗病毒治療，輔助受體的檢測(cè)更顯得具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)也對(duì)CXCR4劣勢(shì)病毒株

3、的檢出敏感性提出了更高的要求。
　　表型法和基因型法是檢測(cè)HIV-1輔助受體常用的方法。表型法是檢測(cè)病毒嗜性的金標(biāo)準(zhǔn)，以Trofile為代表，其對(duì)CXCR4劣勢(shì)株的檢出敏感性較高(0.3-10％)?；蛐头ㄊ歉鶕?jù)gp120的V3區(qū)基因編碼的氨基酸序列，并結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測(cè)工具來(lái)推測(cè)輔助受體的利用情況。兩者相比，基因型法以經(jīng)濟(jì)方便快捷等優(yōu)點(diǎn)被歐洲指南所推薦，但由于對(duì)CXCR4毒株預(yù)測(cè)的敏感度不高(50-70％)，而導(dǎo)致基因型預(yù)測(cè)的結(jié)

4、果與表型檢測(cè)的結(jié)果不完全一致。提高基因型與表型的一致性的手段之一是聯(lián)合應(yīng)用各種生物信息學(xué)預(yù)測(cè)工具，另外則是通過改善實(shí)驗(yàn)技術(shù)提高對(duì)CXCR4劣勢(shì)株的檢出敏感性。
　　近年，深度測(cè)序以操作簡(jiǎn)便、測(cè)序快速等優(yōu)勢(shì)，越來(lái)越多的應(yīng)用在基因型輔助受體的預(yù)測(cè)中。有研究顯示，利用深度測(cè)序技術(shù)結(jié)合輔助受體預(yù)測(cè)工具（如geno2pheno和PSSM）與表型嗜性檢測(cè)法有很好的一致性，且可對(duì)劣勢(shì)病毒株定量，更好的反應(yīng)病毒準(zhǔn)種的構(gòu)成情況。
　　我國(guó)HI

5、V-1流行株與國(guó)外不同，經(jīng)性傳播感染者以CRF01_AE亞型為主，近年我國(guó)經(jīng)男男性行為感染HIV-1的病例也不斷增長(zhǎng)。前瞻性隊(duì)列研究顯示該人群疾病進(jìn)展明顯快于其他人群，該人群疾病進(jìn)展快是否與毒株利用CXCR4輔助受體有關(guān)還需要深入研究，而針對(duì)該人群早期抗病毒治療的用藥選擇也是迫在眉睫的問題。
　　本研究對(duì)62例經(jīng)男男性接觸感染HIV-1的急性感染者血漿病毒進(jìn)行動(dòng)態(tài)研究，采用深度測(cè)序的方法檢測(cè)病毒envelop基因V3區(qū)序列，采用多

6、規(guī)則聯(lián)合應(yīng)用的方法預(yù)測(cè)病毒輔助受體類型，提高CXCR4劣勢(shì)毒株的檢測(cè)敏感性，評(píng)估該人群最初感染病毒中CXCR4株所占比例，以及隨訪1年、2年后輔助受體轉(zhuǎn)化的情況，為該人群早期抗病毒治療以及預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展提供數(shù)據(jù)支持。
　　方法：
　　1、研究對(duì)象
　　我國(guó)東北地區(qū)MSM HIV-1急性感染者62例，滿足以下任何之一或多項(xiàng):(1)3個(gè)月內(nèi)血清HIV抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)者;(2) HIV抗體陰性但HIV RNA陽(yáng)性者;(3) HIV抗體

7、弱陽(yáng)性但在兩周之內(nèi)可以重復(fù)并OD值較前次升高者;(4) HIV抗原陽(yáng)性和/或WB抗體檢測(cè)少于4條蛋白帶者。基線點(diǎn)62例，完成1年隨訪的31例，完成2年隨訪的22例。所有病例研究時(shí)均未接受抗病毒治療。
　　2、HIV-1基因組RNA的提取
　　21000g，4℃離心1小時(shí)，棄掉上清血漿，留管底140μ L血漿。按照QIAampViral RNA Mini Kit操作規(guī)程提取血漿病毒基因組RNA。
　　3、特異性逆轉(zhuǎn)錄

8、r>　　使用特異性下游引物(5'-TCTTGCCTGGAGCTGTTTGATGCCCCAGAC-3'，HXB2:7478-7507)，按照Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche)試劑盒操作要求進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。每個(gè)樣本平行做3份實(shí)驗(yàn)。
　　4、含V3區(qū)目標(biāo)片段的擴(kuò)增
　　按照KOD plus(TOYOBO，Japan)高保真酶試劑盒說(shuō)明書反應(yīng)物終濃度要求，配成總體積為2

9、0μ l的反應(yīng)體系，進(jìn)行兩輪巢氏PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因，第一輪引物對(duì):(5'-TCAGTACAATGYACACATGG-3',HXB2:6500-6519),(5'-GTCYGAGTCACTTCTCCAATT-3'，HXB2:7202-7222);第二輪引物對(duì):(5'-TGTAAAACGACGGCCAGTYTGTTAAATGGYAGYYTAGC-3',HXB2:6548-6567),(5'-CAGGAAACAGCTATGACCTTACAGT

10、AGAAAAATTCCCCT-3',HXB2:6906-6927)。每個(gè)樣本平行做3份實(shí)驗(yàn)。
　　5、深度測(cè)序及序列分析
　　PCR產(chǎn)物純化及定量;進(jìn)行文庫(kù)制備、emPCR擴(kuò)增;雙向測(cè)序;運(yùn)行454GS-JrShotgun Data Processing pipeline程序去掉序列兩端接頭，輸出FastA格式文件。將每個(gè)樣本所測(cè)的reads與該樣本SGA法參考序列做CLUSTAL W比對(duì)，應(yīng)用GSAmplicon Vari

11、ant Analyzer(AVA)軟件修正同聚區(qū)堿基的插入或缺失，保證翻譯閱讀框的完整性。并進(jìn)行序列清理，滿足以下任何之一者刪除該reads:(1)未完全覆蓋V3區(qū);(2) reads中含終止密碼子;(3) reads長(zhǎng)度小于主峰長(zhǎng)度50bp以上。
　　6、深度測(cè)序錯(cuò)誤率評(píng)估及劣勢(shì)株的檢出敏感性
　　將10個(gè)質(zhì)粒平行做sanger測(cè)序和深度測(cè)序，以sanger測(cè)序的結(jié)果作為參考，深度測(cè)序中任何與sanger測(cè)序不一致的堿基即

12、為深度測(cè)序的錯(cuò)誤。計(jì)算10個(gè)質(zhì)粒的平均錯(cuò)誤率，以5倍的平均錯(cuò)誤率作為劣勢(shì)株檢出敏感性的閾值。
　　7、輔助受體預(yù)測(cè)
　　分別采用Geno2pheno[coreceptor]假陽(yáng)性率(FPR)設(shè)為5.75％、WebPSSM基于B亞型的PSSMx4R5和PSSMsinsi、Wetcat的SVM及11/25charge rule五種不同的預(yù)測(cè)工具預(yù)測(cè)病毒株的輔助受體。其中4種以上預(yù)測(cè)為CXCR4的判定為CXCR4毒株，達(dá)不到上述標(biāo)

13、準(zhǔn)的均判定為CCR5毒株。
　　8、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　應(yīng)用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)用中位數(shù)(IQR)表示;用Kaplan-Meier曲線表示從估計(jì)感染時(shí)間到發(fā)生不同結(jié)局事件的估計(jì)中位生存時(shí)間，log-rank檢驗(yàn)比較利用兩種不同輔助受體組的差異，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、研究對(duì)象基本資料
　　基線點(diǎn)62例（平均感染時(shí)間33天），CRF01_AE占80.6％(50/62);完

14、成1年隨訪的31例（平均感染時(shí)間361天），CRF01_ AE占87.1％(27/31);完成2年隨訪的22例（平均感染時(shí)間725天）CRF01_AE占86.4％(19/22)。
　　2、深度測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量的評(píng)估及劣勢(shì)CXCR4的檢出敏感性
　　共115份血漿樣本，成功擴(kuò)增114例。
　　深度測(cè)序114例樣本及10個(gè)質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物，共得到42394條reads，主峰長(zhǎng)度350bp/reads，總通量15Mb。
　

15、　114例樣本得到40464條reads。完成同聚區(qū)堿基校正及reads清理后，剩余38688條reads，平均每個(gè)樣本339條reads。
　　10個(gè)質(zhì)粒的平均錯(cuò)誤率為0.168％，CXCR4劣勢(shì)株的檢出敏感性為1％。
　　3、MSM急性感染者中基線輔助受體基因型構(gòu)成
　　基線時(shí)，含CXCR4劣勢(shì)病毒株的感染者只有2例，全部為CRF01_ AE（全長(zhǎng)分型）。占全部基線感染者的3.28％，占基線時(shí)CRF01_ AE亞型

16、感染者的4.08％。
　　4、MSM急性感染者隨訪1年、2年病毒的輔助受體基因型轉(zhuǎn)換
　　隨訪1年，3例(3/30)基線時(shí)CCR5毒株感染者轉(zhuǎn)換為1年點(diǎn)攜帶CXCR4劣勢(shì)株，這3例感染者全部為CRF01 AE（全長(zhǎng)分型）。含CXCR4劣勢(shì)病毒株感染者占全部1年點(diǎn)感染者的9.68％，占1年點(diǎn)CRF01 AE感染者的11.11％。
　　隨訪2年，4例(4/21)基線時(shí)CCR5毒株感染者轉(zhuǎn)換攜帶CXCR4劣勢(shì)株，這4例感染者

17、全部為CRF01_ AE（全長(zhǎng)分型）。含CXCR4劣勢(shì)病毒株感染者占全部2年點(diǎn)感染者的18.18％，占2年點(diǎn)CRF01 AE感染者的21.05％。
　　5、輔助受體基因型與疾病進(jìn)展的關(guān)系
　　比較感染兩種不同基因型輔助受體感染者疾病進(jìn)展的差異，分別以病毒載量大于10000copies/ml和CD4+T下降到350cells/ul以下作為結(jié)局事件繪制生存曲線。Log-rank檢驗(yàn)顯示分別感染兩種不同基因型輔助受體的感染者的疾病